Składnik chemiczny cewki ze stali nierdzewnej 304. Struktura ektodomeny SPACA6 zawiera konserwatywną nadrodzinę białek związanych z fuzją gamet.

Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Używasz wersji przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS.Aby uzyskać najlepszą jakość, zalecamy użycie zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer).Dodatkowo, aby zapewnić bieżące wsparcie, pokazujemy witrynę bez stylów i JavaScript.
Suwaki pokazujące trzy artykuły na slajd.Użyj przycisków Wstecz i Dalej, aby poruszać się po slajdach, lub przycisków kontrolera slajdów na końcu, aby poruszać się po poszczególnych slajdach.

SPACA6 to białko powierzchniowe wyrażane w plemnikach, które ma kluczowe znaczenie dla fuzji gamet podczas rozmnażania płciowego ssaków.Pomimo tej fundamentalnej roli specyficzna funkcja SPACA6 jest słabo poznana.Wyjaśniamy strukturę krystaliczną domeny zewnątrzkomórkowej SPACA6 w rozdzielczości 2, 2 Å, ujawniając dwudomenowe białko składające się z czteroniciowej wiązki i β-kanapek podobnych do Ig, połączonych quasi-elastycznymi łącznikami.Struktura ta przypomina IZUMO1, inne białko związane z fuzją gamet, czyniąc SPACA6 i IZUMO1 członkami założycielami nadrodziny białek związanych z zapłodnieniem, zwanej tu nadrodziną IST.Nadrodzina IST jest strukturalnie zdefiniowana przez jej skręconą wiązkę czterech helis i parę połączonych dwusiarczkowo motywów CXXC.Oparte na strukturze przeszukiwanie ludzkiego proteomu metodą AlphaFold pozwoliło zidentyfikować dodatkowych członków białek tej nadrodziny;w szczególności wiele z tych białek bierze udział w fuzji gamet.Struktura SPACA6 i jej związek z innymi członkami nadrodziny IST stanowią brakujące ogniwo w naszej wiedzy na temat fuzji gamet ssaków.
Każde życie ludzkie zaczyna się od dwóch oddzielnych haploidalnych gamet: plemnika ojca i komórki jajowej matki.Plemnik ten jest zwycięzcą intensywnego procesu selekcji, podczas którego miliony plemników przedostają się przez drogi rodne kobiety, pokonują różne przeszkody1 i ulegają kapacytacji, co poprawia ich ruchliwość i proces składników powierzchniowych2,3,4.Nawet jeśli plemnik i oocyt odnajdą się, proces ten nie jest jeszcze zakończony.Oocyt jest otoczony warstwą komórek wzgórka i barierą glikoproteinową zwaną osłoną przejrzystą, przez którą musi przejść plemnik, aby dostać się do oocytu.Plemniki wykorzystują kombinację cząsteczek adhezji powierzchniowej oraz enzymów związanych z błoną i wydzielanych, aby pokonać te końcowe bariery5.Te cząsteczki i enzymy są magazynowane głównie w błonie wewnętrznej i macierzy akrosomalnej i są wykrywane podczas lizy zewnętrznej błony plemnika podczas reakcji akrosomalnej6.Ostatnim krokiem w tej intensywnej podróży jest fuzja plemnika i komórki jajowej, podczas której dwie komórki łączą swoje błony, tworząc pojedynczy organizm diploidalny7.Chociaż proces ten jest przełomowy w reprodukcji człowieka, niezbędne interakcje molekularne są słabo poznane.
Oprócz zapłodnienia gamet szeroko badano chemię fuzji dwóch dwuwarstw lipidowych.Ogólnie rzecz biorąc, fuzja membran jest procesem niekorzystnym energetycznie, wymagającym, aby katalizator białkowy przeszedł zmianę konformacji strukturalnej, która zbliża dwie membrany do siebie, przerywając ich ciągłość i powodując fuzję8,9.Te katalizatory białkowe są znane jako fusogeny i można je znaleźć w niezliczonych układach fuzyjnych.Są niezbędne do przedostania się wirusa do komórek gospodarza (np. gp160 w HIV-1, skok w koronaawirusach, hemaglutynina w wirusach grypy)10,11,12 łożysko (syncytyna)13,14,15 i fuzje tworzące gamety u niższych eukariontów ( HAP2/GCS1 u roślin, protistów i stawonogów) 16,17,18,19.Nie odkryto jeszcze fuzogenów ludzkich gamet, chociaż wykazano, że kilka białek ma kluczowe znaczenie dla przyłączania i fuzji gamet.Jako pierwsze odkryto CD9 wyrażany w oocytach, białko przezbłonowe wymagane do fuzji gamet myszy i człowieka 21,22,23.Chociaż jego dokładna funkcja pozostaje niejasna, prawdopodobna wydaje się rola w adhezji, strukturze ognisk adhezyjnych na mikrokosmkach jaja i/lub prawidłowej lokalizacji białek powierzchniowych oocytu24,25,26.Dwa najbardziej typowe białka krytyczne dla fuzji gamet to białko plemnika IZUMO127 i białko oocytu JUNO28, a ich wzajemne powiązanie jest ważnym krokiem w rozpoznawaniu i adhezji gamet przed fuzją.Samce myszy z nokautem Izumo1 i samice myszy z nokautem Juno są całkowicie sterylne, w tych modelach plemniki dostają się do przestrzeni okołowitalnej, ale gamety nie łączą się.Podobnie, konfluencja uległa zmniejszeniu, gdy gamety traktowano przeciwciałami anty-IZUMO1 lub JUNO27,29 w doświadczeniach z zapłodnieniem in vitro na ludziach.
Niedawno odkryto nowo odkrytą grupę białek ulegających ekspresji w plemnikach, fenotypowo podobnych do IZUMO1 i JUNO20,30,31,32,33,34,35.W zakrojonym na szeroką skalę badaniu mutagenezy na myszach uznano, że białko 6 związane z błoną akrosomalną plemnika (SPACA6) jest niezbędne do zapłodnienia.Wstawienie transgenu do genu Spaca6 powoduje powstanie plemników nietopliwych, chociaż plemniki te infiltrują przestrzeń periwitelinową 36 .Późniejsze badania nokautu na myszach potwierdziły, że do fuzji gamet niezbędna jest Spaca630,32.SPACA6 ulega ekspresji prawie wyłącznie w jądrach i ma wzór lokalizacji podobny do IZUMO1, mianowicie w błonie wewnętrznej plemników przed reakcją akrosomalną, a następnie migruje do obszaru równikowego po reakcji akrosomalnej 30,32.Homologi Spaca6 występują u różnych ssaków i innych eukariontów 30, a ich znaczenie dla fuzji ludzkich gamet wykazano poprzez hamowanie zapłodnienia człowieka in vitro przez oporność na SPACA6 30 .W przeciwieństwie do IZUMO1 i JUNO szczegóły struktury, interakcji i funkcji SPACA6 pozostają niejasne.
Aby lepiej zrozumieć podstawowy proces leżący u podstaw fuzji ludzkich plemników i komórek jajowych, co pozwoli nam uzyskać informacje na temat przyszłego rozwoju planowania rodziny i leczenia niepłodności, przeprowadziliśmy badania strukturalne i biochemiczne SPACA6.Struktura krystaliczna domeny zewnątrzkomórkowej SPACA6 przedstawia wiązkę czterohelikalną (4HB) i domenę immunoglobulinopodobną (Ig-podobną) połączoną quasi-elastycznymi regionami.Jak przewidywano w poprzednich badaniach,7,32,37 struktura domeny SPACA6 jest podobna do struktury ludzkiego IZUMO1, a oba białka mają wspólny nietypowy motyw: 4HB z trójkątną spiralną powierzchnią i parą motywów CXXC połączonych dwusiarczkiem.Proponujemy, aby IZUMO1 i SPACA6 zdefiniowały teraz większą, strukturalnie pokrewną nadrodzinę białek związanych z fuzją gamet.Wykorzystując cechy charakterystyczne dla nadrodziny, przeprowadziliśmy wyczerpujące poszukiwania strukturalnego ludzkiego proteomu AlphaFold, identyfikując dodatkowych członków tej nadrodziny, w tym kilku członków zaangażowanych w fuzję gamet i/lub zapłodnienie.Obecnie wydaje się, że istnieje wspólny fałd strukturalny i nadrodzina białek związanych z fuzją gamet, a nasza struktura zapewnia mapę molekularną tego ważnego aspektu mechanizmu fuzji ludzkich gamet.
SPACA6 jest jednoprzebiegowym białkiem transbłonowym z jednym N-glikanem i sześcioma przypuszczalnymi wiązaniami dwusiarczkowymi (ryc. S1a i S2).Ekspresjonowaliśmy domenę zewnątrzkomórkową ludzkiego SPACA6 (reszty 27–246) w komórkach Drosophila S2 i oczyszczaliśmy białko za pomocą chromatografii powinowactwa niklu, wymiany kationowej i wykluczania wielkości (ryc. S1b).Oczyszczona ektodomena SPACA6 jest bardzo stabilna i jednorodna.Analiza za pomocą chromatografii wykluczania wielkości połączonej z wielokątnym rozpraszaniem światła (SEC-MALS) ujawniła jeden pik o obliczonej masie cząsteczkowej 26, 2 ± 0, 5 kDa (ryc. S1c).Jest to zgodne z wielkością monomerycznej ektodomeny SPACA6, co wskazuje, że podczas oczyszczania nie wystąpiła oligomeryzacja.Ponadto spektroskopia dichroizmu kołowego (CD) ujawniła mieszaną strukturę α/β o temperaturze topnienia 51,3 ° C (ryc. S1d, e).Dekonwolucja widm CD ujawniła 38, 6% elementów α-helikalnych i 15, 8% elementów o nici β (rysunek S1d).
Ektodomenę SPACA6 krystalizowano przy użyciu losowego wysiewania macierzy38, w wyniku czego otrzymano zestaw danych o rozdzielczości 2,2 Å (Tabela 1 i Rysunek S3).Wykorzystując kombinację danych dotyczących podstawienia molekularnego opartego na fragmentach i danych dotyczących fazowania SAD z ekspozycją na bromek w celu określenia struktury (Tabela 1 i Rysunek S4), ostateczny udoskonalony model składa się z reszt 27–246.W momencie określania struktury nie były dostępne żadne struktury eksperymentalne ani struktury AlphaFold.Ektodomena SPACA6 ma wymiary 20 Å × 20 Å × 85 Å, składa się z siedmiu helis i dziewięciu nici β i ma wydłużony trzeciorzędowy fałd stabilizowany sześcioma wiązaniami dwusiarczkowymi (ryc. 1a, b).Słaba gęstość elektronów na końcu łańcucha bocznego Asn243 wskazuje, że reszta ta jest N-glikozylacją.Struktura składa się z dwóch domen: N-końcowej wiązki czterech helis (4HB) i C-końcowej domeny Ig-podobnej z pośrednim regionem zawiasowym pomiędzy nimi (ryc. 1c).
a Struktura domeny zewnątrzkomórkowej SPACA6.Diagram paskowy domeny zewnątrzkomórkowej SPACA6, kolor łańcucha od N do C-końca od ciemnoniebieskiego do ciemnoczerwonego.Cysteiny zaangażowane w wiązania dwusiarczkowe zaznaczono kolorem magenta.b Topologia domeny zewnątrzkomórkowej SPACA6.Użyj tego samego schematu kolorów, co na rysunku 1a.c Domena zewnątrzkomórkowa SPACA6.Wykresy paskowe domeny 4HB, zawiasowej i Ig-podobnej są oznaczone odpowiednio kolorem pomarańczowym, zielonym i niebieskim.Warstwy nie są rysowane w skali.
Domena 4HB SPACA6 obejmuje cztery główne helisy (helisy 1–4), które są ułożone w formie helisy helikalnej (ryc. 2a), naprzemiennie między oddziaływaniami antyrównoległymi i równoległymi (ryc. 2b).Mała dodatkowa jednozwojowa helisa (spirala 1′) jest ułożona prostopadle do wiązki, tworząc trójkąt ze spiralami 1 i 2. Trójkąt ten jest nieco zdeformowany w spiralnie skręconym upakowaniu stosunkowo gęstego upakowania helis 3 i 4 ( Ryc. 2a).
Tabela listew zaciskowych 4HB N.b Widok z góry wiązki czterech helis, każda helisa podświetlona na kolor ciemnoniebieski na końcu N i ciemnoczerwony na końcu C.c Schemat koła spiralnego z góry na dół dla 4HB, z każdą resztą przedstawioną jako okrąg oznaczony jednolitym kodem aminokwasu;ponumerowane są tylko cztery aminokwasy na górze koła.Pozostałości niepolarne są zabarwione na żółto, reszty polarne nienaładowane są zabarwione na zielono, reszty naładowane dodatnio są zabarwione na niebiesko, a pozostałości naładowane ujemnie są zabarwione na czerwono.d Trójkątne ściany domeny 4HB, z 4HB w kolorze pomarańczowym i zawiasami w kolorze zielonym.Obie wypustki przedstawiają wiązania dwusiarczkowe w kształcie pręta.
4HB koncentruje się na wewnętrznym hydrofobowym rdzeniu złożonym głównie z reszt alifatycznych i aromatycznych (ryc. 2c).Rdzeń zawiera wiązanie dwusiarczkowe pomiędzy Cys41 i Cys55, które łączy helisy 1 i 2 razem w górnym wypukłym trójkącie (ryc. 2d).Dwa dodatkowe wiązania dwusiarczkowe powstały pomiędzy motywem CXXC w helisie 1 ′ a innym motywem CXXC znalezionym na końcu spinki do włosów β w obszarze zawiasowym (ryc. 2d).Konserwatywna reszta argininy o nieznanej funkcji (Arg37) znajduje się wewnątrz pustego trójkąta utworzonego przez helisy 1′, 1 i 2. Alifatyczne atomy węgla Cβ, Cγ i Cδ Arg37 oddziałują z hydrofobowym rdzeniem, a jego grupy guanidynowe poruszają się cyklicznie między helisami 1 ′ i 1 poprzez interakcje między szkieletem Thr32 a łańcuchem bocznym (ryc. S5a, b).Tyr34 rozciąga się do wnęki, pozostawiając dwie małe wnęki, przez które Arg37 może oddziaływać z rozpuszczalnikiem.
Domeny β-kanapkowe Ig-podobne to duża nadrodzina białek, które mają wspólną cechę dwóch lub więcej wieloniciowych amfipatycznych arkuszy β oddziałujących poprzez hydrofobowy rdzeń 39. C-końcowa domena Ig-podobna SPACA6 ma ten sam wzór i składa się z dwóch warstw (ryc. S6a).Arkusz 1 to arkusz β składający się z czterech pasm (nici D, F, H i I), w którym pasma F, H i I tworzą układ antyrównoległy, a pasma I i D oddziałują równolegle.Tabela 2 przedstawia mały, antyrównoległy arkusz beta (nici E i G).Zaobserwowano wewnętrzne wiązanie dwusiarczkowe pomiędzy końcem C łańcucha E a środkiem łańcucha H (Cys170-Cys226) (ryc. S6b).To wiązanie dwusiarczkowe jest analogiczne do wiązania dwusiarczkowego w domenie kanapkowej β immunoglobuliny40,41.
Czteroplotowy arkusz β skręca się na całej swojej długości, tworząc asymetryczne krawędzie różniące się kształtem i elektrostatyką.Cieńsza krawędź to płaska hydrofobowa powierzchnia środowiska, która wyróżnia się na tle pozostałych nierównych i zróżnicowanych elektrostatycznie powierzchni w SPACA6 (ryc. S6b, c).Aureola odsłoniętych grup karbonylowych/aminowych szkieletu i polarnych łańcuchów bocznych otacza powierzchnię hydrofobową (ryc. S6c).Szerszy margines jest pokryty zamkniętym segmentem spiralnym, który blokuje N-końcową część hydrofobowego rdzenia i tworzy trzy wiązania wodorowe z otwartą grupą polarną szkieletu łańcucha F (ryc. S6d).C-końcowa część tej krawędzi tworzy dużą kieszeń z częściowo odsłoniętym hydrofobowym rdzeniem.Kieszeń jest otoczona ładunkami dodatnimi z powodu trzech zestawów podwójnych reszt argininy (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 i Arg212-Arg214) i centralnej histydyny (His220) (rysunek S6e).
Region zawiasowy to krótki segment pomiędzy domeną helikalną a domeną Ig-podobną, składający się z jednej antyrównoległej trójniciowej warstwy β (nici A, B i C), małej helisy 310 i kilku długich losowych segmentów helikalnych.(Rys. S7).Wydaje się, że sieć kontaktów kowalencyjnych i elektrostatycznych w regionie zawiasowym stabilizuje orientację pomiędzy 4HB a domeną Ig-podobną.Sieć można podzielić na trzy części.Pierwsza część zawiera dwa motywy CXXC (27CXXC30 i 139CXXC142), które tworzą parę wiązań dwusiarczkowych pomiędzy β-szpilką do włosów w zawiasie a helisą 1′ w 4HB.Druga część obejmuje oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy domeną Ig-podobną a zawiasem.Glu132 w zawiasie tworzy mostek solny z Arg233 w domenie Ig-podobnej i Arg135 w zawiasie.Trzecia część zawiera wiązanie kowalencyjne pomiędzy domeną Ig-podobną a regionem zawiasowym.Dwa wiązania dwusiarczkowe (Cys124-Cys147 i Cys128-Cys153) łączą pętlę zawiasową z łącznikiem, który jest stabilizowany przez oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy Gln131 i szkieletową grupą funkcyjną, umożliwiając dostęp do pierwszej domeny Ig-podobnej.łańcuch.
Strukturę ektodomeny SPACA6 oraz poszczególne struktury domen 4HB i Ig-podobnych wykorzystano do wyszukiwania strukturalnie podobnych rekordów w bazach danych białek 42 .Zidentyfikowaliśmy dopasowania z wysokimi wynikami Dali Z, małymi odchyleniami standardowymi i dużymi wynikami LALI (ta ostatnia oznacza liczbę strukturalnie równoważnych reszt).Podczas gdy pierwsze 10 trafień z pełnego wyszukiwania ektodomen (tabela S1) miało akceptowalny wynik Z wynoszący > 842, samo wyszukiwanie domeny 4HB lub Ig-podobnej pokazało, że większość tych trafień odpowiadała tylko β-kanapkom.wszechobecny fałd występujący w wielu białkach.Wszystkie trzy wyszukiwania w Dali zwróciły tylko jeden wynik: IZUMO1.
Od dawna sugerowano, że SPACA6 i IZUMO1 mają podobieństwa strukturalne7,32,37.Chociaż ektodomeny tych dwóch białek związanych z fuzją gamet mają tylko 21% identyczności sekwencji (rysunek S8a), złożone dowody, w tym konserwatywny wzór wiązań dwusiarczkowych i przewidywana C-końcowa domena Ig-podobna w SPACA6, umożliwiły wczesne próby zbudowania model homologii A i myszy SPACA6 wykorzystujący IZUMO1 jako szablon37.Nasza struktura potwierdza te przewidywania i pokazuje prawdziwy stopień podobieństwa.W rzeczywistości struktury SPACA6 i IZUMO137,43,44 mają tę samą architekturę dwóch domen (ryc. S8b) z podobnymi domenami β-kanapkowymi podobnymi do 4HB i Ig, połączonymi regionem zawiasowym (ryc. S8c).
IZUMO1 i SPACA6 4HB różnią się od konwencjonalnych wiązek spiralnych.Typowe 4HB, takie jak te występujące w kompleksach białkowych SNARE biorących udział w fuzji endosomalnej 45,46, mają równomiernie rozmieszczone helisy utrzymujące stałą krzywiznę wokół osi centralnej 47. Natomiast domeny helikalne zarówno w IZUMO1, jak i SPACA6 były zniekształcone, ze zmienną krzywizną i nierówne upakowanie (rysunek S8d).Skręt, prawdopodobnie spowodowany trójkątem utworzonym przez helisy 1′, 1 i 2, jest zachowany w IZUMO1 i SPACA6 i stabilizowany tym samym motywem CXXC na helisie 1′.Jednakże dodatkowe wiązanie dwusiarczkowe znalezione w SPACA6 (Cys41 i Cys55 kowalencyjnie łączące helisy 1 i 2 powyżej) tworzy ostrzejszy wierzchołek na wierzchołku trójkąta, czyniąc SPACA6 bardziej skręconym niż IZUMO1, z bardziej wyraźnymi trójkątami wnęk.Ponadto IZUMO1 nie ma Arg37 obserwowanego w środku tej wnęki w SPACA6.Natomiast IZUMO1 ma bardziej typowy rdzeń hydrofobowy złożony z reszt alifatycznych i aromatycznych.
IZUMO1 ma domenę Ig-podobną składającą się z dwuniciowego i pięcioniciowego β-kartki43.Dodatkowa nić w IZUMO1 zastępuje cewkę w SPACA6, która oddziałuje z nicią F, ograniczając wiązania wodorowe szkieletu w nici.Interesującym punktem porównania jest przewidywany ładunek powierzchniowy domen Ig-podobnych obu białek.Powierzchnia IZUMO1 jest bardziej naładowana ujemnie niż powierzchnia SPACA6.Dodatkowy ładunek znajduje się w pobliżu C-końca zwróconego w stronę błony plemnika.W SPACA6 te same regiony były bardziej neutralne lub naładowane dodatnio (ryc. S8e).Na przykład powierzchnia hydrofobowa (cieńsze krawędzie) i dodatnio naładowane wgłębienia (szersze krawędzie) w SPACA6 są naładowane ujemnie w IZUMO1.
Chociaż powiązania i elementy struktury drugorzędowej między IZUMO1 i SPACA6 są dobrze zachowane, strukturalne dopasowanie domen Ig-podobnych pokazało, że obie domeny różnią się ogólną orientacją względem siebie (ryc. S9).Spiralna wiązka IZUMO1 jest zakrzywiona wokół β-kanapki, tworząc opisany wcześniej kształt „bumerangu” pod kątem około 50° od osi centralnej.Natomiast śrubowa wiązka w SPACA6 została przechylona o około 10° w przeciwnym kierunku.Różnice w tych orientacjach wynikają prawdopodobnie z różnic w obszarze zawiasów.Na poziomie sekwencji pierwszorzędowej IZUMO1 i SPACA6 mają niewielkie podobieństwo sekwencji w zawiasie, z wyjątkiem reszt cysteiny, glicyny i kwasu asparaginowego.W rezultacie wiązania wodorowe i sieci elektrostatyczne są zupełnie inne.Elementy struktury wtórnej arkusza β są wspólne dla IZUMO1 i SPACA6, chociaż łańcuchy w IZUMO1 są znacznie dłuższe, a helisa 310 (helisa 5) jest unikalna dla SPACA6.Różnice te skutkują różnymi orientacjami domen dla dwóch skądinąd podobnych białek.
Nasze przeszukiwanie serwera Dali ujawniło, że SPACA6 i IZUMO1 to jedyne dwie określone eksperymentalnie struktury przechowywane w bazie danych białek, które mają ten konkretny fałd 4HB (Tabela S1).Niedawno w ramach projektu DeepMind (Alphabet/Google) opracowano AlphaFold, system oparty na sieci neuronowej, który może dokładnie przewidywać trójwymiarowe struktury białek na podstawie sekwencji pierwotnych48.Wkrótce po rozwiązaniu struktury SPACA6 opublikowano bazę danych AlphaFold, dostarczającą predykcyjnych modeli struktury obejmujących 98,5% wszystkich białek w ludzkim proteomie48,49.Wykorzystując naszą rozwiązaną strukturę SPACA6 jako model wyszukiwania, poszukiwanie homologii strukturalnej modelu w ludzkim proteomie AlphaFold zidentyfikowało kandydatów o możliwych podobieństwach strukturalnych do SPACA6 i IZUMO1.Biorąc pod uwagę niesamowitą dokładność AlphaFold w przewidywaniu SPACA6 (ryc. S10a) - zwłaszcza ektodomenę o wartości skutecznej 1,1 Å w porównaniu z naszą rozdzieloną strukturą (ryc. S10b) - możemy być pewni, że zidentyfikowane dopasowania SPACA6 prawdopodobnie będą dokładne.
Wcześniej w ramach projektu PSI-BLAST poszukiwano klastra IZUMO1 za pomocą trzech innych białek związanych z plemnikami: IZUMO2, IZUMO3 i IZUMO450.AlphaFold przewidział, że te białka z rodziny IZUMO składają się w domenę 4HB z tym samym wzorem wiązań dwusiarczkowych co IZUMO1 (ryc. 3a i S11), chociaż brakuje im domeny Ig-podobnej.Przypuszcza się, że IZUMO2 i IZUMO3 są jednostronnymi białkami błonowymi podobnymi do IZUMO1, podczas gdy IZUMO4 wydaje się być wydzielane.Nie określono funkcji białek IZUMO 2, 3 i 4 w fuzji gamet.Wiadomo, że IZUMO3 odgrywa rolę w biogenezie akrosomów podczas rozwoju plemników51 i stwierdzono, że białko IZUMO tworzy kompleks50.Konserwacja białek IZUMO u ssaków, gadów i płazów sugeruje, że ich potencjalna funkcja jest zgodna z funkcją innych znanych białek związanych z fuzją gamet, takich jak DCST1/2, SOF1 i FIMP.
Schemat architektury domen nadrodziny IST, z domenami 4HB, zawiasowymi i Ig-podobnymi zaznaczonymi odpowiednio na pomarańczowo, zielono i niebiesko.IZUMO4 ma unikalny obszar C-końcowy, który wygląda na czarny.Potwierdzone i domniemane wiązania dwusiarczkowe pokazano odpowiednio liniami ciągłymi i przerywanymi.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) i TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) i TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) są wyświetlane w tym samym zakresie kolorów co panel A. Wiązania dwusiarczkowe są pokazane w kolorze magenta.Helisy transbłonowe TMEM95, IZUMO2 i IZUMO3 nie są pokazane.
W przeciwieństwie do białka IZUMO, uważa się, że inne białka SPACA (tj. SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 i SPACA9) różnią się strukturalnie od SPACA6 (ryc. S12).Tylko SPACA9 ma 4HB, ale nie oczekuje się, że będzie miał tę samą orientację równoległą-antyrównoległą lub to samo wiązanie dwusiarczkowe co SPACA6.Tylko SPACA1 ma podobną domenę Ig-podobną.AlphaFold przewiduje, że SPACA3, SPACA4 i SPACA5 mają zupełnie inną strukturę niż SPACA6.Co ciekawe, wiadomo również, że SPACA4 odgrywa rolę w zapłodnieniu, ale w większym stopniu niż SPACA6, zamiast tego ułatwia interakcję między plemnikiem a osłoną przezroczystą oocytu52.
Nasza wyszukiwarka AlphaFold znalazła kolejne dopasowanie dla IZUMO1 i SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, pojedyncze białko przezbłonowe specyficzne dla plemnika, powoduje bezpłodność samców myszy po ablacji 32,33.Plemniki pozbawione TMEM95 miały normalną morfologię, ruchliwość i zdolność przenikania przez warstwę przezroczystą i wiązania się z błoną jaja, ale nie mogły połączyć się z błoną oocytu.Poprzednie badania wykazały, że TMEM95 ma podobieństwa strukturalne z IZUMO133.Rzeczywiście, model AlphaFold potwierdził, że TMEM95 to 4HB z tą samą parą motywów CXXC co IZUMO1 i SPACA6 oraz tym samym dodatkowym wiązaniem dwusiarczkowym między helisami 1 i 2 znalezionym w SPACA6 (ryc. 3a i S11).Chociaż TMEM95 nie ma domeny Ig-podobnej, ma region o wzorze wiązań dwusiarczkowych podobny do regionów zawiasowych SPACA6 i IZUMO1 (ryc. 3b).W momencie publikacji tego manuskryptu serwer przeddruku zgłosił strukturę TMEM95, potwierdzając wynik AlphaFold53.TMEM95 jest bardzo podobny do SPACA6 i IZUMO1 i jest ewolucyjnie konserwatywny już u płazów (ryc. 4 i S13).
W wyszukiwaniu PSI-BLAST wykorzystano bazy danych NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP i SOF1 w celu określenia pozycji tych sekwencji w drzewie życia.Odległości pomiędzy punktami rozgałęzień nie są pokazane w skali.
Uderzające ogólne podobieństwo strukturalne między SPACA6 i IZUMO1 sugeruje, że są one członkami założycielami konserwatywnej nadrodziny strukturalnej, która obejmuje białka TMEM95 oraz IZUMO 2, 3 i 4.znani członkowie: IZUMO1, SPACA6 i TMEM95.Ponieważ tylko kilku członków posiada domeny Ig-podobne, cechą charakterystyczną nadrodziny IST jest domena 4HB, która ma unikalne cechy wspólne dla wszystkich tych białek: 1) Skręcony 4HB z helisami ułożonymi naprzemiennie antyrównolegle/równolegle (ryc. 5a), 2) wiązka ma trójkątną ścianę składającą się z dwóch helis w wiązce i trzeciej pionowej helisy (rys. kluczowy obszar (ryc. 5c). Wiadomo, że motyw CXXC, występujący w białkach tioredoksynopodobnych, działa jako czujnik redoks 54,55,56, podczas gdy motyw u członków rodziny IST może być powiązany z izomerazami dwusiarczkowymi białek, takimi jak ERp57, w fuzji gamet.Role są powiązane 57,58.
Członkowie nadrodziny IST są definiowani przez trzy charakterystyczne cechy domeny 4HB: cztery helisy naprzemiennie o orientacji równoległej i antyrównoległej, trójkątne helikalne ściany wiązek ba i podwójny motyw ca CXXC utworzony pomiędzy małymi cząsteczkami.) N-końcowe helisy (pomarańczowe) i region zawiasowy β-spinka do włosów (zielony).
Biorąc pod uwagę podobieństwo SPACA6 i IZUMO1, zbadano zdolność tego pierwszego do wiązania się z IZUMO1 lub JUNO.Interferometria biowarstw (BLI) to kinetyczna metoda wiązania, którą stosowano wcześniej do ilościowego określenia interakcji między IZUMO1 i JUNO.Po inkubacji czujnika znakowanego biotyną z IZUMO1 jako przynętą o wysokim stężeniu analitu JUNO wykryto silny sygnał (ryc. S14a), wskazujący na wywołaną wiązaniem zmianę grubości biomateriału przymocowanego do końcówki czujnika.Podobne sygnały (tj. JUNO sprzężone z czujnikiem jako przynęta przeciwko analitowi IZUMO1) (ryc. S14b).Nie wykryto żadnego sygnału, gdy SPACA6 zastosowano jako analit przeciwko IZUMO1 związanemu z czujnikiem lub JUNO związanym z czujnikiem (rysunek S14a, b).Brak tego sygnału wskazuje, że domena zewnątrzkomórkowa SPACA6 nie oddziałuje z domeną zewnątrzkomórkową IZUMO1 lub JUNO.
Ponieważ test BLI opiera się na biotynylacji wolnych reszt lizyny na białku przynęty, modyfikacja ta może zapobiec wiązaniu, jeśli w interakcji biorą udział reszty lizyny.Ponadto orientacja wiązania względem czujnika może tworzyć przeszkody przestrzenne, dlatego przeprowadzono również konwencjonalne testy pull-down na rekombinowanych ektodomenach SPACA6, IZUMO1 i JUNO.Mimo to SPACA6 nie wytrącił się z IZUMO1 ze znacznikiem His lub JUNO ze znacznikiem His (ryc. S14c, d), co wskazuje na brak interakcji zgodny z obserwowaną w eksperymentach BLI.Jako kontrolę pozytywną potwierdziliśmy interakcję JUNO ze znakowanym His IZUMO1 (ryc. S14e i S15).
Pomimo podobieństwa strukturalnego między SPACA6 i IZUMO1, niezdolność SPACA6 do wiązania JUNO nie jest zaskakująca.Powierzchnia ludzkiego IZUMO1 ma ponad 20 reszt oddziałujących z JUNO, w tym reszty z każdego z trzech regionów (chociaż większość z nich zlokalizowana jest w regionie zawiasowym) (ryc. S14f).Z tych reszt tylko jedna jest konserwowana w SPACA6 (Glu70).Podczas gdy wiele podstawień reszt zachowało swoje pierwotne właściwości biochemiczne, zasadnicza reszta Arg160 w IZUMO1 została zastąpiona ujemnie naładowaną resztą Asp148 w SPACA6;poprzednie badania wykazały, że mutacja Arg160Glu w IZUMO1 prawie całkowicie znosi wiązanie z JUNO43.Ponadto różnica w orientacji domen między IZUMO1 i SPACA6 znacznie zwiększyła powierzchnię miejsca wiązania JUNO równoważnego regionu na SPACA6 (ryc. S14g).
Pomimo znanej potrzeby SPACA6 do fuzji gamet i jego podobieństwa do IZUMO1, SPACA6 nie wydaje się mieć równoważnej funkcji wiązania JUNO.Dlatego staraliśmy się połączyć nasze dane strukturalne z dowodami znaczenia dostarczonymi przez biologię ewolucyjną.Dopasowanie sekwencji homologów SPACA6 pokazuje zachowanie wspólnej struktury poza ssakami.Na przykład reszty cysteiny występują nawet u odległych płazów (ryc. 6a).Za pomocą serwera ConSurf zmapowano dane dotyczące przechowywania wielu dopasowań sekwencji 66 sekwencji na powierzchnię SPACA6.Ten rodzaj analizy może wykazać, które reszty zostały zachowane podczas ewolucji białka i może wskazać, które obszary powierzchni odgrywają rolę.
a Dopasowanie sekwencji ektodomen SPACA6 z 12 różnych gatunków przygotowanych przy użyciu CLUTAL OMEGA.Jak wynika z analizy ConSurf, kolorem niebieskim zaznaczono najbardziej konserwatywne stanowiska.Reszty cysteiny zaznaczono na czerwono.Granice domen i elementy struktury drugorzędnej są pokazane w górnej części linii trasowania, gdzie strzałki wskazują nici β, a fale wskazują helisy.Identyfikatory dostępu NCBI zawierające sekwencje to: człowiek (Homo sapiens, NP_001303901), mandryl (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), kapucynka (Cebus mimic, XP_017359366), koń (Equus caballus, XP_023506102), orka (Orcinus orca3_23 XP_0 32_034) .; 18), Platypus, 8) , 61_89 i Żaba rycząca (Bufo bufo, XP_040282113).Numeracja opiera się na porządku ludzkim.b Reprezentacja powierzchni struktury SPACA6 z 4HB na górze i domeną Ig-podobną na dole, kolory oparte na szacunkach ochrony z serwera ConSurf.Najlepiej zachowane części są zaznaczone na niebiesko, średnio zachowane części są na biało, a najmniej zachowane na żółto.fioletowa cysteina.We wstawce oznaczonej etykietami 1, 2 i 3 pokazano trzy naszywki powierzchniowe charakteryzujące się wysokim poziomem ochrony. We wstawce w prawym górnym rogu pokazano rysunek 4HB (ten sam schemat kolorów).
Struktura SPACA6 ma trzy wysoce konserwatywne obszary powierzchni (ryc. 6b).Łatka 1 obejmuje 4HB i region zawiasowy i zawiera dwa konserwatywne mostki disiarczkowe CXXC, sieć zawiasów Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (ryc. S7) i trzy konserwatywne zewnętrzne reszty aromatyczne (Phe31, Tyr73, Phe137)).szersze obrzeże domeny Ig-podobnej (ryc. S6e), która reprezentuje kilka dodatnio naładowanych reszt na powierzchni plemnika.Co ciekawe, ten plaster zawiera epitop przeciwciała, który, jak wcześniej wykazano, zakłóca funkcję SPACA6 30.Region 3 obejmuje zawias i jedną stronę domeny Ig-podobnej;region ten zawiera konserwatywne proliny (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) i skierowane na zewnątrz reszty polarne/naładowane.Co zaskakujące, większość reszt na powierzchni 4HB jest wysoce zmienna (ryc. 6b), chociaż fałd jest zachowany w całym homologu SPACA6 (na co wskazuje konserwatyzm hydrofobowego rdzenia wiązki) i poza nadrodziną IST.
Chociaż jest to najmniejszy region w SPACA6 z najmniejszą wykrywalną liczbą elementów struktury drugorzędnej, wiele pozostałości regionu zawiasowego (w tym region 3) jest wysoce konserwatywnych wśród homologów SPACA6, co może wskazywać, że orientacja wiązki helikalnej i β-kanapki odgrywa rolę.jako konserwatysta.Jednakże pomimo rozległych wiązań wodorowych i sieci elektrostatycznych w obszarze zawiasowym SPACA6 i IZUMO1, dowody wewnętrznej elastyczności można zobaczyć w wyrównaniu wielu dozwolonych struktur IZUMO137,43,44.Wyrównanie poszczególnych domen dobrze się nakładało, ale orientacja domen względem siebie zmieniała się od 50° do 70° od osi środkowej (ryc. S16).Aby zrozumieć dynamikę konformacyjną SPACA6 w roztworze, przeprowadzono eksperymenty SAXS (ryc. S17a, b).Rekonstrukcja ab initio ektodomeny SPACA6 była zgodna ze strukturą kryształu prętowego (ryc. S18), chociaż wykres Kratky'ego wykazał pewien stopień elastyczności (ryc. S17b).Konformacja ta kontrastuje z IZUMO1, w której niezwiązane białko przyjmuje kształt bumerangu zarówno w sieci, jak i w roztworze43.
Aby konkretnie zidentyfikować elastyczny obszar, przeprowadzono spektroskopię mas z wymianą wodoru i deuteru (H-DXMS) na SPACA6 i porównano z danymi uzyskanymi wcześniej na IZUMO143 (ryc. 7a, b).SPACA6 jest wyraźnie bardziej elastyczna niż IZUMO1, o czym świadczy wyższa wymiana deuteru w całej strukturze po 100 000 s wymiany.W obu strukturach C-końcowa część regionu zawiasowego wykazuje wysoki poziom wymiany, co prawdopodobnie umożliwia ograniczoną rotację domen 4HB i Ig-podobnych względem siebie.Co ciekawe, C-końcowa część zawiasu SPACA6, składająca się z reszty 147CDLPLDCP154, jest wysoce konserwatywnym regionem 3 (ryc. 6b), co prawdopodobnie wskazuje, że elastyczność międzydomenowa jest ewolucyjnie konserwatywną cechą SPACA6.Zgodnie z analizą elastyczności dane dotyczące topnienia termicznego CD wykazały, że SPACA6 (Tm = 51,2°C) jest mniej stabilny niż IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (ryc. S1e i S19).
a Obrazy H-DXMS SPACA6 i b IZUMO1.We wskazanych punktach czasowych oznaczono procentową wymianę deuteru.Poziomy wymiany wodoru i deuteru są oznaczone kolorem w skali gradientu od niebieskiego (10%) do czerwonego (90%).Czarne skrzynki reprezentują obszary o wysokiej wymianie.Granice domeny 4HB, zawiasowej i Ig-podobnej obserwowane w strukturze kryształu pokazano powyżej sekwencji pierwszorzędowej.Poziomy wymiany deuteru po 10 s, 1000 s i 100 000 s wykreślono na wykresie paskowym nałożonym na przezroczyste powierzchnie molekularne SPACA6 i IZUMO1.Części konstrukcji, w których poziom wymiany deuteru jest niższy niż 50%, są zabarwiane na biało.Obszary powyżej 50% wymiany H-DXMS są kolorowane w skali gradientowej.
Zastosowanie strategii genetycznych CRISPR/Cas9 i nokautu genu myszy doprowadziło do identyfikacji kilku czynników ważnych dla wiązania i fuzji plemników i komórek jajowych.Oprócz dobrze scharakteryzowanej interakcji struktury IZUMO1-JUNO i CD9, większość białek związanych z fuzją gamet pozostaje strukturalnie i funkcjonalnie zagadkowa.Charakterystyka biofizyczna i strukturalna SPACA6 to kolejny element molekularnej układanki adhezji/fuzji podczas zapłodnienia.
Wydaje się, że SPACA6 i inni członkowie nadrodziny IST są wysoce konserwatywni u ssaków, a także u pojedynczych ptaków, gadów i płazów;w rzeczywistości uważa się, że SPACA6 jest nawet wymagane do zapłodnienia danio pręgowanego 59. Rozkład ten jest podobny do innych znanych białek związanych z fuzją gamet, takich jak DCST134, DCST234, FIMP31 i SOF132, co sugeruje, że w tych czynnikach występuje niedobór HAP2 (również znane jako białka GCS1), które są odpowiedzialne za aktywność katalityczną wielu protistów., rośliny i stawonogi.Zapłodnione białka fuzyjne 60, 61. Pomimo silnego podobieństwa strukturalnego między SPACA6 i IZUMO1, nokaut genów kodujących którekolwiek z tych białek spowodował bezpłodność u samców myszy, co wskazuje, że ich funkcje w fuzji gamet nie są powielane..Mówiąc szerzej, żadne ze znanych białek plemnika wymaganych w fazie adhezji fuzji nie jest zbędne.
Otwartym pytaniem pozostaje, czy SPACA6 (i inni członkowie nadrodziny IST) uczestniczą w połączeniach międzygametycznych, tworzą sieci wewnątrzgametyczne w celu rekrutacji ważnych białek do punktów fuzji, a może nawet działają jako nieuchwytne fuzogeny.Badania koimmunoprecypitacji w komórkach HEK293T ujawniły interakcję pomiędzy pełnej długości IZUMO1 i SPACA632.Jednakże nasze rekombinowane ektodomeny nie wchodziły w interakcje in vitro, co sugeruje, że interakcje obserwowane w Noda i in.oba zostały usunięte w konstrukcie (zwróć uwagę na ogon cytoplazmatyczny IZUMO1, który, jak wykazano, jest niepotrzebny do zapłodnienia62).Alternatywnie, IZUMO1 i/lub SPACA6 mogą wymagać specyficznych środowisk wiązania, których nie odtwarzamy in vitro, takich jak fizjologicznie specyficzne konformacje lub kompleksy molekularne zawierające inne białka (znane lub jeszcze nie odkryte).Chociaż uważa się, że ektodomena IZUMO1 pośredniczy w przyłączaniu plemników do komórki jajowej w przestrzeni periwitelinowej, cel ektodomeny SPACA6 jest niejasny.
Struktura SPACA6 ujawnia kilka konserwatywnych powierzchni, które mogą brać udział w interakcjach białko-białko.Konserwatywna część regionu zawiasowego bezpośrednio przylegająca do motywu CXXC (oznaczona jako Łatka 1 powyżej) ma kilka skierowanych na zewnątrz reszt aromatycznych, które często są związane z oddziaływaniami hydrofobowymi i interakcjami typu π między biocząsteczkami.Szerokie boki domeny Ig-podobnej (region 2) tworzą dodatnio naładowany rowek z wysoce konserwatywnymi resztami Arg i His, a przeciwciała przeciwko temu regionowi stosowano wcześniej do blokowania fuzji gamet 30 .Przeciwciało rozpoznaje liniowy epitop 212RIRPAQLTHRGTFS225, który ma trzy z sześciu reszt argininy i wysoce konserwatywne His220.Nie jest jasne, czy dysfunkcja wynika z zablokowania tych konkretnych reszt, czy też całego regionu.Położenie tej przerwy w pobliżu C-końca β-kanapki wskazuje na interakcje cis z sąsiadującymi białkami plemnika, ale nie z białkami oocytu.Co więcej, zachowanie bardzo elastycznego splotu bogatego w prolinę (miejsce 3) w obrębie zawiasu może być miejscem interakcji białko-białko lub, co bardziej prawdopodobne, wskazywać na zachowanie elastyczności między dwiema domenami.Płeć ma znaczenie dla nieznanej roli SPACA6.fuzja gamet.
SPACA6 ma właściwości białek adhezyjnych międzykomórkowych, w tym β-kanapek Ig-podobnych.Wiele białek adhezyjnych (np. kadheryny, integryny, adhezyny i IZUMO1) posiada jedną lub więcej domen β-kanapkowych, które rozciągają białka od błony komórkowej do ich celów środowiskowych63,64,65.Domena Ig-podobna SPACA6 zawiera również motyw powszechnie spotykany w β-kanapkach o adhezji i kohezji: dublety równoległych pasm na końcach β-kanapek, znane jako zaciski mechaniczne66.Uważa się, że motyw ten zwiększa odporność na siły ścinające, co jest cenne dla białek biorących udział w interakcjach międzykomórkowych.Jednak pomimo tego podobieństwa do adhezyn, obecnie nie ma dowodów na to, że SPACA6 wchodzi w interakcję z białkami jaj.Ektodomena SPACA6 nie jest w stanie wiązać się z JUNO, a komórki HEK293T wyrażające SPACA6, jak pokazano tutaj, prawie nie oddziałują z oocytami pozbawionymi strefy 32 .Jeśli SPACA6 ustanowi wiązania międzygametyczne, interakcje te mogą wymagać modyfikacji potranslacyjnych lub zostać ustabilizowane przez inne białka plemnika.Na poparcie tej ostatniej hipotezy plemniki z niedoborem IZUMO1 wiążą się z oocytami, co pokazuje, że cząsteczki inne niż IZUMO1 biorą udział w etapie adhezji gamet 27 .
Wiele wirusowych, komórkowych i rozwojowych białek fuzyjnych ma właściwości, które pozwalają przewidzieć ich funkcję jako fuzogenów.Na przykład wirusowe glikoproteiny fuzyjne (klasy I, II i III) mają hydrofobowy peptyd fuzyjny lub pętlę na końcu białka, które jest wstawiane do błony gospodarza.Mapa hydrofilowości IZUMO143 i struktura (określona i przewidywana) nadrodziny IST nie wykazały widocznego hydrofobowego peptydu fuzyjnego.Zatem, jeśli jakiekolwiek białka z nadrodziny IST funkcjonują jako fuzogeny, robią to w sposób odmienny od innych znanych przykładów.
Podsumowując, funkcje członków nadrodziny białek IST związanych z fuzją gamet pozostają kuszącą tajemnicą.Nasza scharakteryzowana rekombinowana cząsteczka SPACA6 i jej rozwiązana struktura zapewnią wgląd w powiązania między tymi wspólnymi strukturami i ich rolę w przyłączaniu i fuzji gamet.
Sekwencję DNA odpowiadającą przewidywanej ludzkiej ektodomenie SPACA6 (numer dostępu NCBI NP_001303901.1; reszty 27–246) zoptymalizowano pod kątem kodonów do ekspresji w komórkach Drosophila melanogaster S2 i zsyntetyzowano jako fragment genu z sekwencją kodującą Kozak (Eurofins Genomics)., sygnał wydzielania BiP i odpowiednie końce 5' i 3' do niezależnego od ligacji klonowania tego genu do wektora ekspresyjnego pMT w oparciu o promotor metalotioneiny zmodyfikowany pod kątem selekcji puromycyną (pMT-puro).Wektor pMT-puro koduje miejsce rozszczepienia trombiny, po którym następuje znacznik C-końcowy 10x-His (Rysunek S2).
Stabilną transfekcję wektora pMT-puro SPACA6 do komórek D. melanogaster S2 (Gibco) przeprowadzono podobnie do protokołu stosowanego dla IZUMO1 i JUNO43.Komórki S2 rozmrożono i hodowano w pożywce Schneidera (Gibco) uzupełnionej końcowym stężeniem 10% (v/v) inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (Gibco) i 1X antybiotyku przeciwgrzybiczego (Gibco).Komórki wczesnego pasażu (3,0 x 106 komórek) wysiano do poszczególnych dołków płytek 6-dołkowych (Corning).Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 27°C komórki transfekowano mieszaniną 2 mg wektora SPACA6 pMT-puro i odczynnika do transfekcji Effectene (Qiagen) zgodnie z protokołem producenta.Transfekowane komórki inkubowano przez 72 godziny, a następnie zebrano za pomocą 6 mg/ml puromycyny.Komórki następnie izolowano z pełnej pożywki Schneidera i umieszczano w wolnej od surowicy pożywce Insect-XPRESS (Lonza) w celu produkcji białka na dużą skalę.1-litrową partię hodowli komórek S2 hodowano do 8–10 x 106 ml-1 komórek w 2-litrowej wentylowanej polipropylenowej kolbie Erlenmeyera, a następnie sterylizowano do końcowego stężenia 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) i sterylnie filtrowano.wywołany.Indukowane hodowle inkubowano w temperaturze 27°C przy 120 obr./min. przez cztery dni.
Kondycjonowaną pożywkę zawierającą SPACA6 izolowano przez wirowanie przy 5660 x g w 4°C, a następnie przez system filtracji z przepływem stycznym Centramate (Pall Corp) z membraną 10 kDa MWCO.Nałożyć stężone podłoże zawierające SPACA6 na kolumnę z 2 ml żywicy agarozowej Ni-NTA (Qiagen).Żywicę Ni-NTA przemyto 10 objętościami kolumny (CV) buforu A, a następnie dodano 1 CV buforu A, aby uzyskać końcowe stężenie imidazolu wynoszące 50 mM.SPACA6 eluowano 10 ml buforu A uzupełnionego imidazolem do końcowego stężenia 500 mM.Trombinę klasy restrykcyjnej (Millipore Sigma) dodano bezpośrednio do rurki do dializy (MWCO 12-14 kDa) w dawce 1 jednostka na mg SPACA6 w porównaniu z 1 l 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 i 150 mM NaCl (bufor B) do dializy.) w temperaturze 4°C przez 48 godzin.Następnie rozszczepiony trombiną SPACA6 rozcieńczono trzykrotnie w celu zmniejszenia stężenia soli i nałożono na 1 ml kolumnę kationowymienną MonoS 5/50 GL (Cytiva/GE) zrównoważoną 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Wymieniacz kationowy przemyto 3 CV 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, następnie SPACA6 eluowano liniowym gradientem od 0 do 500 mM NaCl w 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 dla 25 CV.Po chromatografii jonowymiennej SPACA6 zatężono do 1 ml i eluowano izokratycznie z kolumny ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) zrównoważonej buforem B. Zgodnie z chromatogramem połącz i zatęż frakcje zawierające SPACA6.Czystość kontrolowano metodą elektroforezy barwionej Coomassie na 16% żelu poliakryloamidowym SDS.Stężenie białka oznaczono ilościowo poprzez absorbancję przy 280 nm, stosując prawo Beera-Lamberta i teoretyczny współczynnik ekstynkcji molowej.
Oczyszczony SPACA6 dializowano przez noc wobec 10 mM fosforanu sodu, pH 7,4 i 150 mM NaF i rozcieńczono do 0,16 mg/ml przed analizą metodą spektroskopii CD.Skanowanie widmowe płyt CD o długości fali od 185 do 260 nm zebrano na spektropolarymetrze Jasco J-1500 przy użyciu kuwet kwarcowych o długości ścieżki optycznej 1 mm (Helma) w temperaturze 25°C z szybkością 50 nm/min.Widma CD skorygowano względem linii bazowej, uśredniono z 10 akwizycji i przeliczono na średnią eliptyczność resztkową (θMRE) w stopniach cm2/dmol:
gdzie MW to masa cząsteczkowa każdej próbki w Da;N to liczba aminokwasów;θ to eliptyczność w milistopniach;d odpowiada długości ścieżki optycznej w cm;stężenie białka w jednostkach.