347 12,7 * 1,24 mm Zwijane rurki ze stali nierdzewnej, Molekularny mechanizm synchronicznej kondensacji elektrostatycznej i koagregacji α-synukleiny i tau

Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Używasz wersji przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS.Aby uzyskać najlepszą jakość, zalecamy użycie zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer).Dodatkowo, aby zapewnić bieżące wsparcie, pokazujemy witrynę bez stylów i JavaScript.
Suwaki pokazujące trzy artykuły na slajd.Użyj przycisków Wstecz i Dalej, aby poruszać się po slajdach, lub przycisków kontrolera slajdów na końcu, aby poruszać się po poszczególnych slajdach.

Specyfikacja rur ze stali nierdzewnej 347

347 12,7*1,24 mm Zwijane rurki ze stali nierdzewnej

Średnica zewnętrzna: 6,00 mm OD do 914,4 mm OD, rozmiary do 24” NB dostępne z magazynu, rozmiar OD Dostępne rury stalowe z magazynu

Zakres grubości rur SS 347: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S itp. (0,5-12mm) Lub nieregularny rozmiar do dostosowania według potrzeb

Typ: Rury bez szwu SS 347 |Rury SS 347 ERW |Rury spawane SS 347 |Rury prefabrykowane SS 347 |Rury SS 347 CDW, rury LSAW / spawane ze szwami / przeciągane

Forma: Rury/rurki okrągłe SS 347, Rury/rurki kwadratowe SS 347, Rury/rurki prostokątne SS 347, Rury zwijane SS 347, Kształt SS 347 w kształcie litery „U”, SS 347 Zwoje do ciasta naleśnikowego, Rury hydrauliczne SS 347

Długość: pojedyncza losowa, podwójna losowa i wymagana długość Koniec: gładki koniec, skośny koniec, bieżnikowany

Ochrona końcowa: Plastikowe nakładki |Wykończenie zewnętrzne: 2B, nr 4, nr 1, nr 8 Wykończenie lustrzane do rur ze stali nierdzewnej, wykończenie zgodnie z wymaganiami klienta

Stan dostawy: wyżarzane i marynowane, polerowane, wyżarzane na biało, ciągnione na zimno

Inspekcja, raporty z testów: Certyfikaty testów walcowni, EN 10204 3.1, raporty chemiczne, raporty mechaniczne, raporty z testów PMI, raporty z inspekcji wizualnej, raporty z inspekcji stron trzecich, raporty z laboratorium zatwierdzonego przez NABL, raporty z testów niszczących, raporty z testów nieniszczących

Pakowanie: Pakowane w drewniane pudełka, plastikowe torby, stalowe paski w wiązkach lub zgodnie z życzeniami klientów

Specjalne: Rozmiary i specyfikacje inne niż powyższe mogą być produkowane na zamówienie

Zakres rozmiarów rur SS 347: 1/2 cala NB, OD do 24 cali

ASTM A312 347: Rury austenityczne bez szwu ze szwem prostym, przeznaczone do pracy w wysokich temperaturach i ogólnych warunkach korozyjnych.Metal dodatkowy nie jest dozwolony podczas spawania.

ASTM A358 347: Rura austenityczna spawana elektrycznie do zastosowań korozyjnych i/lub wysokotemperaturowych.Zazwyczaj zgodnie z tą specyfikacją produkowane są tylko rury o średnicy do 8 cali.Dopuszczalne jest dodawanie spoiwa podczas spawania.

ASTM A790 347: Rura ferrytyczno-austenityczna (duplex) bez szwu ze szwem prostym, przeznaczona do ogólnych zastosowań korozyjnych, ze szczególnym naciskiem na odporność na pękanie korozyjne naprężeniowe.

ASTM A409 347: Rura austenityczna o lekkich ściankach, ze szwem prostym lub spiralnym, spawana elektrycznie o dużej średnicy w rozmiarach od 14” do 30” ze ściankami Sch5S i Sch 10S do zastosowań korozyjnych i/lub o wysokiej

ASTM A376 347: Bezszwowa rura austenityczna do zastosowań wysokotemperaturowych.

ASTM A813 347: Rura austenityczna z pojedynczym szwem, pojedynczo lub podwójnie spawana do zastosowań wysokotemperaturowych i ogólnych zastosowań korozyjnych.

ASTM A814 347: Obrobiona na zimno, spawana rura austenityczna do zastosowań w wysokich temperaturach i ogólnych warunkach korozyjnych.

Rury ze stali nierdzewnej 347H Skład chemiczny

Właściwości mechaniczne rur ze stali nierdzewnej 347H

Właściwości fizyczne rur ze stali nierdzewnej 347H

Gatunki równoważne dla rur ze stali nierdzewnej 347H

Agregacja alfa-synukleiny amyloidu (αS) jest cechą charakterystyczną choroby Parkinsona i innych synukleinopatii.Ostatnio białko tau powszechnie kojarzone z chorobą Alzheimera powiązano z patologią αS i stwierdzono, że kolokalizuje się we wtrąceniach bogatych w αS, chociaż molekularny mechanizm koagregacji tych dwóch białek pozostaje niejasny.Podajemy tutaj, że faza αS rozdziela się na ciekłe kondensaty poprzez elektrostatyczną kondensację złożoną z dodatnio naładowanymi polipeptydami, takimi jak tau.W zależności od powinowactwa αS do polikationów i szybkości wyczerpywania się wartościowości sieci krzepnięcia, skrzepy ulegają szybkiemu żelowaniu lub koalescencji, po czym następuje powolna agregacja amyloidu.Łącząc zestaw zaawansowanych technik biofizycznych, byliśmy w stanie scharakteryzować rozdział faz ciecz-ciecz αS/Tau i zidentyfikować kluczowe czynniki prowadzące do powstania heterogenicznych agregatów zawierających oba białka w ciekłym kondensacie białek.
Oprócz przedziałów błonowych separację przestrzenną w komórkach można również osiągnąć poprzez tworzenie bogatych w białka, gęstych ciał przypominających ciecz, zwanych kondensatami lub kropelkami biomolekularnymi, w procesie znanym jako separacja fazy ciecz-ciecz (LLPS).Krople te powstają w wyniku wielowartościowych interakcji czasowych, zwykle między białkami lub białkami i RNA, i pełnią różnorodne funkcje w prawie wszystkich żywych układach.Duża liczba białek zdolnych do LLP wykazuje sekwencje o niskiej złożoności, które mają wysoce nieuporządkowany charakter i tworzą kondensaty biomolekularne3,4,5.Liczne badania eksperymentalne ujawniły elastyczny, często nieuporządkowany i wielowartościowy charakter białek tworzących te ciekłe kondensaty, chociaż niewiele wiadomo na temat specyficznych determinantów molekularnych kontrolujących wzrost i dojrzewanie tych kondensatów do postaci bardziej stałej. państwo..
Nowe dane potwierdzają hipotezę, że nieprawidłowy LLPS napędzany białkami i przekształcanie kropelek w stałe struktury mogą być istotnymi szlakami komórkowymi prowadzącymi do tworzenia nierozpuszczalnych toksycznych agregatów, które często są cechą charakterystyczną chorób zwyrodnieniowych.Wiele białek wewnętrznie nieuporządkowanych (IDP) związanych z LLPS, często silnie naładowanych i elastycznych, od dawna wiąże się z neurodegeneracją w procesie agregacji amyloidu.W szczególności wykazano, że biomolekularne kondensaty IDP, takie jak FUS7 lub TDP-438, lub białka o dużych domenach o niskiej złożoności, takie jak hnRNPA19, starzeją się do postaci żelowych lub nawet stałych w procesie zwanym fluidyzacją.mieszanina.do przejścia do fazy stałej (LSPT) w funkcji czasu lub w odpowiedzi na pewne modyfikacje potranslacyjne lub patologicznie istotne mutacje1,7.
Innym IDP powiązanym z LLPS in vivo jest Tau, nieuporządkowane białko związane z mikrotubulami, którego agregację amyloidu powiązano z chorobą Alzheimera10, ale ostatnio powiązano ją także z chorobą Parkinsona (PD) i innymi synaptycznymi proteinopatiami jądrowymi11, 12, 13.Wykazano, że Tau spontanicznie dysocjuje z roztworu/cytoplazmy w wyniku korzystnych interakcji elektrostatycznych14, w wyniku czego powstają kropelki wzbogacone w tau, zwane koacerwatami elektrostatycznymi.Zaobserwowano również, że tego typu niespecyficzne oddziaływanie jest siłą napędową wielu kondensatów biomolekularnych w przyrodzie15.W przypadku białka tau agregację elektrostatyczną można utworzyć w drodze prostej agregacji, w której przeciwnie naładowane obszary białka uruchamiają proces rozszczepienia, lub w drodze złożonej agregacji poprzez interakcję z ujemnie naładowanymi polimerami, takimi jak RNA.
Niedawno w modelach komórkowych i zwierzęcych wykazano, że α-synukleina (αS), IDP amyloidu powiązany z chorobą Parkinsona i innymi chorobami neurodegeneracyjnymi znanymi łącznie jako synukleinopatia17,18, jest skoncentrowana w kondensatach białkowych o zachowaniu przypominającym płyn.Badania in vitro wykazały, że αS ulega LLPS poprzez prostą agregację w wyniku głównie oddziaływań hydrofobowych, chociaż proces ten wymaga wyjątkowo wysokich stężeń białek i nietypowo długich czasów inkubacji19,21.Kluczowym nierozwiązanym problemem pozostaje to, czy kondensaty zawierające αS obserwowane in vivo powstają w tym czy innym procesie LLPS.Podobnie, chociaż agregację amyloidu αS zaobserwowano w neuronach w chorobie Parkinsona i innych synukleinopatiach, dokładny mechanizm, dzięki któremu αS ulega wewnątrzkomórkowej agregacji amyloidu, pozostaje niejasny, ponieważ nie wydaje się, aby nadekspresja tego białka sama w sobie wyzwalała ten proces.Często wymagane jest dodatkowe uszkodzenie komórek, co sugeruje, że do renukleacji wewnątrzkomórkowych zespołów amyloidu αS wymagane są określone lokalizacje komórkowe lub mikrośrodowiska.Środowiskiem komórkowym szczególnie podatnym na agregację może być wnętrze kondensatów białkowych23.
Co ciekawe, stwierdzono, że αS i tau kolokalizują się w charakterystycznych wtrętach chorobowych u ludzi z chorobą Parkinsona i innymi synukleinopatiami 24,25, a eksperymenty wykazały synergistyczny patologiczny związek między tymi dwoma białkami 26,27 sugerując potencjalny związek pomiędzy agregacją αS i tau w chorobach neurodegeneracyjnych.choroba.Stwierdzono, że αS i tau oddziałują i sprzyjają wzajemnej agregacji in vitro i in vivo 28,29, a heterogeniczne agregaty złożone z tych dwóch białek obserwowano w mózgach pacjentów z synukleinopatiami 30 .Niewiele jednak wiadomo na temat molekularnych podstaw interakcji między αS i tau oraz mechanizmu jego koagregacji.Doniesiono, że αS oddziałuje z tau poprzez przyciąganie elektrostatyczne pomiędzy silnie naładowanym ujemnie naładowanym regionem C-końcowym αS a centralnym regionem tau bogatym w prolinę, który jest również wzbogacony w reszty naładowane dodatnio.
W tym badaniu pokazujemy, że αS rzeczywiście może dysocjować na kropelki poprzez elektrostatyczną kondensację kompleksu w obecności białka tau, w przeciwieństwie do jego interakcji z innymi dodatnio naładowanymi polipeptydami, takimi jak poli-L-lizyna (pLK), i w tym procesie.αS działa jako cząsteczka rusztowania dla sieci kropel.Zidentyfikowaliśmy zauważalne różnice w procesie dojrzewania elektrostatycznych koacerwatów αS, które są związane z różnicami w wartościowości i sile oddziaływania białek biorących udział w sieci koacerwatu.Co ciekawe, zaobserwowaliśmy koagregację białek amyloidu αS i tau w długożyciowych płynnych koacerwatach i zidentyfikowaliśmy kilka kluczowych czynników, które prowadzą do koagregacji tych dwóch białek w takich koacerwatach.Tutaj szczegółowo opisujemy ten proces, który jest możliwym mechanizmem molekularnym leżącym u podstaw kolokalizacji dwóch białek we wtrętach specyficznych dla choroby.
αS ma wysoce anionowy ogon C-końcowy w obojętnym pH (ryc. 1a) i postawiliśmy hipotezę, że może on ulegać LLPS poprzez kondensację kompleksów elektrostatycznych z polikationowymi nieuporządkowanymi cząsteczkami polipeptydowymi.Zastosowaliśmy 100-resztową poli-L-lizynę (pLK) jako wyjściową cząsteczkę modelową ze względu na jej dodatnio naładowany i nieuporządkowany charakter polimeru przy obojętnym pH 32. Po pierwsze, potwierdziliśmy, że pLK oddziałuje z domeną Ct αS za pomocą spektroskopii roztworowego NMR (Rysunek 1b) przy użyciu αS znakowanego 13C/15N w obecności rosnących stosunków molowych αS:pLK.Oddziaływanie pLK z domeną Ct αS objawia się zaburzeniami przesunięcia chemicznego i spadkiem intensywności piku w tym obszarze białka.Co ciekawe, kiedy zmieszaliśmy αS z pLK przy stężeniu αS wynoszącym ok.5–25 µM w obecności glikolu polietylenowego (5–15% PEG-8) (typowy bufor LLPS: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) od razu przeszliśmy przez szerokie pole tworzenia białek .kropelki obserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (WF) i jasnego pola (BF) (ryc. 1c).Krople o średnicy 1-5 µm zawierające stężony αS (dodano 1 µM αS znakowany AlexaFluor488, AF488-αS), ich właściwości elektrostatyczne można wywnioskować z ich odporności na 10% 1,6-heksanodiolu (1,6-HD) i jego wrażliwości na wzrost stężenia NaCl (ryc. 1c).Płynny charakter koacerwatów kompleksu elektrostatycznego αS / pLK wykazuje ich zdolność do fuzji w ciągu milisekund (ryc. 1d).Za pomocą turbidymetrii określiliśmy ilościowo powstawanie kropelek w tych warunkach, potwierdziliśmy elektrostatyczny charakter głównego oddziaływania związanego z jego stabilnością (ryc. 1e) i oceniliśmy wpływ różnych proporcji polimerów na proces LLPS (ryc. 1f).Chociaż tworzenie kropelek obserwuje się w szerokim zakresie stosunków polimeru, proces jest bardzo korzystny, gdy pLK przekracza αS.LLP obserwowano również przy użyciu chemicznie innego środka wypierającego dekstran-70 (70 kDa) lub przy użyciu różnych formatów próbek, w tym kropli szkiełka, studzienek mikropłytek z różnych materiałów, kapilar Eppendorfa lub kwarcu.
a Schematyczne przedstawienie różnych regionów białek w wariantach WT-αS i ΔCt-αS zastosowanych w tym badaniu.Amfipatyczna domena N-końcowa, hydrofobowy region tworzący amyloid (NAC) i ujemnie naładowana domena C-końcowa są pokazane odpowiednio w kolorze niebieskim, pomarańczowym i czerwonym.Pokazano mapę ładunku netto na resztę (NCPR) WT-αS.b Analiza NMR interakcji αS/pLK przy braku grudek makromolekularnych.Wraz ze wzrostem stężenia pLK (stosunki molowe αS:pLK wynoszące 1:0,5, 1:1,5 i 1:10 pokazano odpowiednio w kolorze jasnozielonym, zielonym i ciemnozielonym).c Koacerwatuj αS/pLK (stosunek molowy 1:10) w stężeniu 25 µM (1 µM αS znakowany AF488 lub pLK znakowany Atto647N do obrazowania WF) w buforze LLPS (na górze) lub uzupełnionym 500 mM NaCl (na dole po lewej) lub po 10 % 1,6-heksanodiolu (1,6-HD; na dole po prawej).Pasek skali = 20 µm.d Reprezentatywne obrazy mikroskopowe fuzji kropelek BF αS/pLK (stosunek molowy 1:10) w stężeniu 25 µM;strzałki wskazują połączenie poszczególnych kropli (czerwona i żółta strzałka) w nową kroplę (pomarańczowa strzałka) w ciągu 200 ms).Pasek skali = 20 µm.e Rozpraszanie światła (przy 350 nm) Agregacja αS/pLK w buforze LLPS przed i po dodaniu 500 mM NaCl lub 10% 1,6-HD przy 25 µM αS (N = 3 powtórzenia próbki, wskazano również średnią i odchylenie standardowe).f Obraz BF (na górze) i analiza rozpraszania światła (przy 350 nm, na dole) agregacji αS/pLK przy 25 µM αS ze wzrostem stosunku molowego αS:pLK (N = 3 powtórzenia próbki, wskazano również średnią i odchylenie standardowe).Pasek skali = 10 µm.Pasek skali na jednym obrazie wskazuje skalę wszystkich obrazów w jednym panelu.Surowe dane są dostarczane w postaci surowych plików danych.
W oparciu o nasze obserwacje kondensacji kompleksu elektrostatycznego αS/pLK i wcześniejsze obserwacje αS jako cząsteczki klienta kondensatu tau/RNA poprzez bezpośrednią interakcję z tau31, postawiliśmy hipotezę, że αS i tau mogą współsegregować z rozpuszczalnikiem pod nieobecność RNA kondensacja.przez kompleksy elektrostatyczne, a αS jest białkiem rusztowania w koacerwatach αS/Tau (patrz rozkład ładunku tau na Figurze 2e).Zaobserwowaliśmy, że gdy 10 µM αS i 10 µM Tau441 (zawierające odpowiednio 1 µM AF488-αS i 1 µM Atto647N-Tau) zmieszano razem w buforze LLPS, łatwo utworzyły agregaty białkowe zawierające oba białka, co widać pod mikroskopem WF.(ryc. 2a).Kolokalizację dwóch białek w kropelkach potwierdzono za pomocą mikroskopii konfokalnej (CF) (rysunek uzupełniający 1a).Podobne zachowanie zaobserwowano, gdy jako środek agregujący zastosowano dekstran-70 (rysunek uzupełniający 1c).Stosując PEG lub dekstran znakowany FITC, odkryliśmy, że oba środki stłoczące były równomiernie rozmieszczone w próbkach, nie wykazując ani segregacji, ani asocjacji (rysunek uzupełniający 1d).Sugeruje raczej, że w tym układzie sprzyjają one rozdzielaniu faz poprzez efekty stłoczenia makrocząsteczek, ponieważ PEG jest preferencyjnie stabilnym środkiem stłoczącym, jak widać w innych układach LLP33,34.Te bogate w białko kropelki były wrażliwe na NaCl (1 M), ale nie na 1,6-HD (10% obj./obj.), co potwierdza ich właściwości elektrostatyczne (rysunek uzupełniający 2a, b).Ich płynne zachowanie zostało potwierdzone poprzez obserwację milisekundowych zdarzeń łączenia kropel za pomocą mikroskopii BF (ryc. 2b).
obrazy z mikroskopii konfokalnej (CF) koacerwatów αS/Tau441 w buforze LLPS (10 µM każdego białka, 0,5 µM αS znakowanego AF488 i Tau441 znakowanego Atto647N).b Reprezentatywne obrazy z kontrastem różnicowo-interferencyjnym (DIC) zdarzeń fuzji kropelek αS/Tau441 (10 µM dla każdego białka).c Diagram fazowy oparty na rozpraszaniu światła (przy 350 nm) Tau441 LLPS (0–15 µM) przy braku (po lewej) lub obecności (po prawej) 50 µM αS.Cieplejsze kolory wskazują na większe rozproszenie.d Rozpraszanie światła próbek αS/Tau441 LLPS wraz ze wzrostem stężenia αS (Tau441 przy 5 µM, N = 2–3 powtórzenia próbki, jak wskazano).e Schematyczne przedstawienie niektórych wariantów białka tau i różnych regionów białka wykorzystanych w tym badaniu: ujemnie naładowana domena N-końcowa (czerwona), region bogaty w prolinę (niebieski), domena wiążąca mikrotubule (MTBD, zaznaczona na pomarańczowo) oraz spirala par tworzących amyloid.obszary włókien (PHF) zlokalizowane w MTBD (szary).Pokazano mapę ładunku netto na pozostałość (NCPR) Tau441.f Używając 1 µM αS znakowanego AF488 i ΔNt- znakowanego Atto647N, stosując 1 µM αS lub ΔCt-αS znakowanego AF488 w obecności ΔNt-Tau (na górze, 10 µM na białko) lub K18 (na dole, 50 µM na białko ) ) ) mikrografie WF skondensowanego w buforze LLPS lub K18.Paski skali na jednym obrazie przedstawiają skalę wszystkich obrazów w jednym panelu (20 µm dla paneli a, b i f).Surowe dane dla paneli c i d są dostarczane jako surowe pliki danych.
Aby przetestować rolę αS w tym procesie LLPS, najpierw zbadaliśmy wpływ αS na stabilność kropel za pomocą nefelometrii, stosując rosnące stężenia NaCl (ryc. 2c).Im wyższe stężenie soli w próbkach zawierających αS, tym wyższe wartości rozproszenia światła (przy 350 nm), co wskazuje na stabilizującą rolę αS w tym układzie LLPS.Podobny efekt można zaobserwować zwiększając stężenie αS (a co za tym idzie stosunek αS:Tau441) do ok.10-krotny wzrost w stosunku do stężenia tau (5 µM) (ryc. 2d).Aby wykazać, że αS jest białkiem rusztowania w koacerwatach, postanowiliśmy zbadać zachowanie mutanta Tau z zakłóceniem LLPS, któremu brakuje ujemnie naładowanego regionu N-końcowego (reszty 1–150, patrz ryc. 2e) zwanego ΔNt-Tau.Mikroskopia i nefelometria WF potwierdziły, że sam ΔNt-Tau nie uległ LLPS (ryc. 2f i ryc. uzupełniający 2d), jak podano wcześniej 14. Jednakże, gdy αS dodano do roztworów dyspersyjnych tego skróconego wariantu Tau, proces LLPS został całkowicie przywrócony z gęstością kropel bliską gęstości kropel pełnowymiarowych roztworów Tau i αS w podobnych warunkach i stężeniach białek.Proces ten można również zaobserwować w warunkach niskiego stłoczenia makrocząsteczek (rysunek uzupełniający 2c).Rolę C-końcowego regionu αS, ale nie całej jego długości, w procesie LLPS wykazano poprzez hamowanie tworzenia kropelek przy użyciu C-końcowego skróconego wariantu αS pozbawionego reszt 104–140 (ryc. 1a) (ΔCt- białko αS) (ryc. 2f i ryc. uzupełniająca 2d).Kolokalizację αS i ΔNt-Tau potwierdzono za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej (rysunek uzupełniający 1b).
W celu dalszego testowania mechanizmu LLPS między Tau441 i αS wykorzystano dodatkowy wariant Tau, a mianowicie fragment sparowanego helikalnego rdzenia włókienkowego (PHF) w domenie wiążącej mikrotubule (MTBD), który, jeśli zawiera cztery charakterystyczne powtarzające się domeny, powszechnie znane również jako fragment K18 (patrz ryc. 2e).Niedawno doniesiono, że αS preferencyjnie wiąże się z białkiem tau zlokalizowanym w domenie bogatej w prolinę, w sekwencji poprzedzającej domenę wiążącą mikrotubule.Jednak region PHF jest również bogaty w reszty naładowane dodatnio (patrz rysunek 2e), zwłaszcza lizynę (15% reszt), co skłoniło nas do sprawdzenia, czy region ten również przyczynia się do kondensacji kompleksu αS/Tau.Zaobserwowaliśmy, że sam K18 nie może wywołać LLPS w stężeniach do 100 µM w testowanych warunkach (bufor LLPS z 15% PEG lub 20% dekstranu) (Rysunek 2f).Jednakże, gdy dodaliśmy 50 µM αS do 50 µM K18, za pomocą nefelometrii (rysunek uzupełniający 2d) i mikroskopii WF (ryc. 2f) zaobserwowano szybkie tworzenie się kropelek białka zawierających K18 i αS.Zgodnie z oczekiwaniami, ΔCt-αS nie był w stanie przywrócić zachowania LLPS K18 (ryc. 2f).Zauważamy, że agregacja αS/K18 wymaga nieco wyższych stężeń białka do indukcji LLPS w porównaniu z αS/ΔNt-Tau lub αS/Tau441, przy innych czynnikach niezmiennych.Jest to zgodne z silniejszym oddziaływaniem regionu C-końcowego αS z bogatą w prolinę domeną Tau w porównaniu z domeną wiążącą mikrotubule, jak opisano wcześniej 31 .
Biorąc pod uwagę, że ΔNt-Tau nie może wykonać LLPS w przypadku braku αS, wybraliśmy ten wariant Tau jako model do charakteryzowania LLPS αS/Tau, biorąc pod uwagę jego prostotę w systemach LLPS z Tau pełnej długości (izotyp, Tau441/Tau441).ze złożonymi (heterotypowymi, αS/Tau441) procesami agregacji.Porównaliśmy stopień agregacji αS (jako część białka fazy skondensowanej, fαS,c) w układach αS/Tau i αS/ΔNt-Tau poprzez wirowanie i analizę SDS-PAGE w fazie rozproszonej (patrz 2e), stwierdziliśmy bardzo podobne wartości dla wszystkich białek w tym samym stężeniu.W szczególności otrzymaliśmy fαS,c 84 ± 2% i 79 ± 7% odpowiednio dla αS/Tau i αS/ΔNt-Tau, co sugeruje, że heterotypowa interakcja między αS i tau jest lepsza niż interakcja między cząsteczkami tau.między.
Najpierw zbadano interakcję z różnymi polikationami i wpływ procesu kondensacji na kinetykę αS metodą odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu (FRAP).Przetestowaliśmy koacerwaty αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau i αS/pLK (100 µM αS uzupełnione 2 µM αS AF488-αS i 100 µM Tau441 lub ΔNt-Tau lub 1 mM pLK).Dane uzyskano w ciągu pierwszych 30 minut po wymieszaniu składników próbki.Z reprezentatywnych obrazów FRAP (ryc. 3a, kondensacja αS / Tau441) i odpowiadających im krzywych przebiegu w czasie (ryc. 3b, ryc. uzupełniająca 3) widać, że kinetyka αS jest bardzo podobna do kinetyki koacerwatów Tau441.i ΔNt-Tau, który jest znacznie szybszy w przypadku pLK.Obliczone współczynniki dyfuzji dla αS wewnątrz koacerwatu według FRAP (jak opisali Kang i in. 35) wynoszą D = 0,013 ± 0,009 µm2/s i D = 0,026 ± 0,008 µm2/s dla αS/Tau441 i αS/ΔNt- dla układu αS/.Odpowiednio pLK, Tau i D = 0,18 ± 0,04 µm2/s (ryc. 3c).Jednak współczynnik dyfuzji αS w fazie rozproszonej jest o kilka rzędów wielkości wyższy niż we wszystkich fazach skondensowanych, jak określono za pomocą fluorescencyjnej spektroskopii korelacji (FCS, patrz dodatkowa rys. 3) w tych samych warunkach (bufor LLPS), ale przy braku polikationów ( D = 8 ± 4 µm2/s).Dlatego kinetyka translacji αS jest znacznie zmniejszona w koacerwatach w porównaniu z białkami w fazie rozproszonej ze względu na wyraźne efekty stłoczenia molekularnego, chociaż wszystkie koacerwaty zachowują właściwości podobne do cieczy przez pierwsze pół godziny po ich utworzeniu, w przeciwieństwie do fazy tau.szybsza kinetyka w kondensacie pLK.
a – c Analiza FRAP dynamiki αS (2% αS znakowana AF488) w koacerwatach elektrostatycznych.Reprezentatywne obrazy testów FRAP αS/Tau441 w trzech powtórzeniach pokazano w (a), gdzie czerwone kółka wskazują obszary odbarwione.Pasek skali wynosi 5 µm.b Średnie krzywe FRAP i (c) obliczone współczynniki dyfuzji (D) dla 5–6 (N) różnych kropelek z trzech eksperymentów z użyciem 100 µM αS i równomolowych stężeń Tau441 (czerwony) lub ΔNt-Tau (niebieski) lub pLK (zielony) przy dziesięciokrotnym stężeniu LLPS.Odchylenie standardowe krzywej FRAP pokazano zacieniowanym kolorem.Dla porównania współczynnik dyfuzji αS w fazie rozproszonej określono trzykrotnie za pomocą spektroskopii korelacyjnej fluorescencji (FCS) (więcej informacji można znaleźć w dodatkowym rysunku 3 i metodach).d Ciągłe widma EPR w paśmie X 100 µM TEMPOL-122-αS w buforze LLPS bez polikationu (czarny) lub w obecności 100 µM Tau441 (czerwony) lub ΔNt-Tau (niebieski) lub 1 mM pLK (zielony).Wstawka przedstawia powiększony widok linii silnego pola, w których zachodzą najbardziej dramatyczne zmiany.e Krzywe wiązania 50 µM TEMPOL-122-αS z różnymi polikationami przy braku LLPS (bez PEG).Wykazano, że zmniejszona amplituda pasma III w porównaniu z pasmem II (III/III) znormalizowanego widma EPR zwiększa stosunki molowe Tau441 (czerwony), ΔNt-Tau (niebieski) i pLK (zielony).Kolorowe linie pokazują dopasowanie do danych przy użyciu przybliżonego modelu wiązania z n identycznymi i niezależnymi miejscami wiązania na każdej krzywej.Surowe dane są dostarczane w postaci surowych plików danych.
Jako uzupełnienie zbadaliśmy dynamikę αS w różnych koacerwatach za pomocą znakowania ukierunkowanego spinu (SDSL) i ciągłego elektronowego rezonansu paramagnetycznego (CW-EPR).Metoda ta okazała się bardzo przydatna w raportowaniu elastyczności i dynamiki IDP z realistyczną rozdzielczością resztkową36,37,38.W tym celu skonstruowaliśmy reszty cysteiny w pojedynczych mutantach Cys i zastosowaliśmy sondę spinową 4-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylopiperydyno-N-oksyl (TEMPOL).Oznaczą je pochodne maleimidu.Dokładniej, wstawiliśmy sondy TEMPOL w pozycji 122 lub 24 αS (TEMPOL-122-αS i TEMPOL-24-αS).W pierwszym przypadku naszym celem jest region C-końcowy białka, który bierze udział w interakcji z polikationami.Zamiast tego pozycja 24 może dostarczyć nam informacji o ogólnej dynamice białek w kondensacie.W obu przypadkach sygnały EPR uzyskane dla białek fazy rozproszonej odpowiadały rodnikom nitroksydowym w stanie szybko poruszającym się.Po rozdzieleniu faz w obecności tau lub pLK (100 µM TEMPOL-αS, Tau441 lub ΔNt-Tau w stosunku 1:1 lub pLK w stosunku 1:10) zaobserwowano wzrost względnej intensywności piku w widmo EPR αS.Linia straty poszerzyła się, wskazując zmniejszoną kinetykę reorientacji αS w kropelkach w porównaniu z białkiem w fazie rozcieńczonej (ryc. 3d, ryc. Uzupełniająca 4a).Zmiany te są bardziej wyraźne w pozycji 122. Podczas gdy w pozycji 24 obecność pLK nie miała wpływu na kinetykę sondy, w pozycji 122 kształt linii widmowej zmienił się znacząco (rysunek uzupełniający 4a).Kiedy próbowaliśmy modelować widma w pozycji 122 dwóch układów αS / polikationów przy użyciu modelu izotropowego (rysunek uzupełniający 5a) powszechnie używanego do opisu dynamiki IDP38,39 znakowanego spinem, nie byliśmy w stanie zrekonstruować widm eksperymentalnych..Symulacja widmowa położenia 24 kontrastów spinów (rysunek uzupełniający 5a).Sugeruje to, że istnieją preferencyjne pozycje w przestrzeni konfiguracji spinów regionu C-końcowego αS w obecności polikationów.Rozważając frakcję αS w fazie skondensowanej w eksperymentalnych warunkach EPR (odpowiednio 84 ± 2%, 79 ± 7% i 47 ± 4% dla αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau i αS/pLK – patrz Uzupełnienie Rys. 2e analizy danych c) można zauważyć, że poszerzenie wykryte metodą EPR odzwierciedla głównie interakcję regionu C-końcowego αS z różnymi polikationami w fazie skondensowanej (główna zmiana w przypadku stosowania TEMPOL-122- αS), a nie kondensację białek.W sondzie obserwuje się wzrost mikrolepkości.Zgodnie z oczekiwaniami widmo EPR białka w warunkach innych niż LLPS zostało całkowicie przywrócone, gdy do mieszaniny dodano 1 M NaCl (rysunek uzupełniający 4b).Ogólnie rzecz biorąc, nasze dane sugerują, że zmiany wykryte przez CW-EPR odzwierciedlają głównie interakcję regionu C-końcowego αS z różnymi polikationami w fazie skondensowanej, a interakcja ta wydaje się silniejsza w przypadku pLK niż w przypadku Tau.
Aby uzyskać więcej informacji strukturalnych na temat białek w koacerwacie, postanowiliśmy zbadać system LLPS za pomocą NMR w roztworze.Mogliśmy jednak wykryć jedynie frakcję αS pozostałą w fazie rozproszonej, co może wynikać ze zmniejszonej dynamiki białka wewnątrz koacerwatu i gęstej fazy na dnie roztworu w analizie NMR.Kiedy analizowaliśmy strukturę i dynamikę białka pozostałego w fazie rozproszonej próbki LLPS za pomocą NMR (rysunek uzupełniający 5c, d), zauważyliśmy, że białko zachowywało się prawie identycznie w obecności pLK i ΔNt-Tau, oba które dotyczyły struktury drugorzędowej i dynamiki szkieletu białka, ujawnione w eksperymentach z wtórnym przesunięciem chemicznym i relaksacją R1ρ.Dane NMR pokazują, że koniec C αS ulega znacznej utracie elastyczności konformacyjnej, zachowując jednocześnie swój nieuporządkowany charakter, podobnie jak reszta sekwencji białka, z powodu jego interakcji z polikationami.
Ponieważ poszerzenie sygnału CW-EPR obserwowane w fazie skondensowanej TEMPOL-122-αS odzwierciedla interakcję białka z polikationami, przeprowadziliśmy miareczkowanie EPR w celu oceny powinowactwa wiązania αS do różnych polikationów przy braku LLPS (brak akumulacji Bufor LLPS), co sugeruje, że interakcje są takie same w fazach rozcieńczonych i stężonych (co potwierdzają nasze dane, rys. uzupełniający 4a i ryc. 6).Celem było sprawdzenie, czy wszystkie koacerwaty, pomimo ich wspólnych właściwości płynopodobnych, wykazują jakiekolwiek podstawowe zróżnicowane zachowanie na poziomie molekularnym.Zgodnie z oczekiwaniami widmo EPR rozszerzyło się wraz ze wzrostem stężenia polikationu, odzwierciedlając spadek elastyczności molekularnej w wyniku interakcji molekularnych wszystkich partnerów interakcji prawie do nasycenia (ryc. 3e, ryc. uzupełniająca 6).pLK osiągnął to nasycenie przy niższym stosunku molowym (polikation: αS) w porównaniu z ΔNt-Tau i Tau441.W rzeczywistości porównanie danych z przybliżonym modelem wiązania zakładającym n identycznych i niezależnych miejsc wiązania wykazało, że pozorna stała dysocjacji pLK (~5 μM) jest o rząd wielkości niższa niż Tau441 lub ΔNt-Tau (~50 μM ).uM).Chociaż jest to przybliżone oszacowanie, sugeruje to, że αS ma większe powinowactwo do prostszych polikationów z ciągłymi obszarami ładunku dodatniego.Biorąc pod uwagę tę różnicę w powinowactwie między αS i różnymi polikationami, postawiliśmy hipotezę, że ich właściwości cieczy mogą zmieniać się w różny sposób w czasie, a zatem podlegają różnym procesom LSPT.
Biorąc pod uwagę bardzo zatłoczone środowisko w koacerwacie białkowym i amyloidową naturę białka, zaobserwowaliśmy zachowanie koacerwatu w czasie, aby wykryć możliwe procesy LSPT.Korzystając z mikroskopii BF i CF (rysunek 4), zaobserwowaliśmy, że αS / Tau441 koacerwuje w dużym stopniu w roztworze, tworząc duże kropelki, które stykają się i zwilżają powierzchnię na dnie studzienki/ślizgają się jako pełne kropelki, zgodnie z oczekiwaniami (rysunek uzupełniający 7d);nazywamy te struktury uformowane na dnie „tratwami białkowymi”.Struktury te pozostały płynne, ponieważ zachowały zdolność do łączenia się (rysunek uzupełniający 7b) i można je było zobaczyć przez kilka godzin po uruchomieniu LLPS (ryc. 4 i ryc. Uzupełniający 7c).Zaobserwowaliśmy, że proces zwilżania jest preferowany na powierzchni materiałów hydrofilowych, a nie hydrofobowych (rysunek uzupełniający 7a), zgodnie z oczekiwaniami w przypadku koacerwatów elektrostatycznych z niezrównoważonymi ładunkami, a tym samym wysokimi potencjałami powierzchni elektrostatycznej.Warto zauważyć, że koalescencja i rafting αS/ΔNt-Tau zostały znacznie zmniejszone, podczas gdy kondensaty αS/pLK zostały znacznie zmniejszone (ryc. 4).Podczas krótkiego czasu inkubacji kropelki αS/pLK były zdolne do koalescencji i zwilżenia powierzchni hydrofilowej, ale proces ten szybko ustał i po 5 godzinach inkubacji zaobserwowano jedynie ograniczone zjawiska koalescencji i brak zwilżania.– przejście żel-kropelka.
Reprezentatywne BF (panele w skali szarości) i CF (prawy panel, αS oznaczony AF488 na zielono) próbek koacerwatu zawierających 100 µM αS (1% znacznik fluorescencyjny) w buforze LLPS w obecności 100 µM Tau441 (górna) fluorescencja) obrazy mikroskopowe ΔNt -Tau (w środku) lub 1 mM pLK (na dole) przy różnych czasach inkubacji i wysokościach ogniskowych (z, odległość od dna dołka płytki).Doświadczenia powtarzano 4-6 razy niezależnie od siebie, uzyskując takie same wyniki.Koacerwaty αS/Tau441 zwilżają się po 24 godzinach, tworząc tratwy większe niż na zdjęciu.Pasek skali dla wszystkich obrazów wynosi 20 µm.
Następnie zapytaliśmy, czy duże, przypominające płyn pule białek utworzone w αS/Tau441 LLPS będą prowadzić do agregacji amyloidu któregokolwiek z badanych białek.Śledziliśmy dojrzewanie kropelek αS / Tau441 w czasie za pomocą mikroskopii WF w tych samych warunkach co powyżej, ale przy użyciu 1 μM αS znakowanego AF488 i Tau441 znakowanego Atto647N (ryc. 5a).Zgodnie z oczekiwaniami zaobserwowaliśmy pełną lokalizację białka w całym procesie dojrzewania.Co ciekawe, od ok.Po 5 godzinach wewnątrz tratw zaobserwowano bardziej intensywne nieokrągłe struktury, które nazwaliśmy „punktami”, z których część była kolokalizowana z αS, a część została wzbogacona w Tau441 (ryc. 5a, białe strzałki).Plamy te zawsze obserwowano w obrębie tratw w większym stopniu dla αS/ΔNt-Tau niż dla αS/ΔNt-Tau.Nie było wyraźnych plam w kropelkach systemów pLK i Tau niezdolnych do stapiania/zwilżania.Aby sprawdzić, czy te plamy zawierające αS i Tau441 są agregatami podobnymi do amyloidu, przeprowadziliśmy podobny eksperyment przy użyciu mikroskopii CF, w którym Tau441 znakowano Atto647N i od początku dodano 12,5 µM tioflawiny-T specyficznej dla amyloidu (ThT).barwnik.Chociaż barwienia ThT kropelek lub tratw αS / Tau441 nie zaobserwowano nawet po 24 godzinach inkubacji (ryc. 5b, górny rząd - pozostałe kropelki na tratwach białkowych), struktury ThT-dodatnie zawierające Atto647N-Tau441 wewnątrz tratw były bardzo słabe.odtwarza to rozmiar, kształt i położenie wcześniej opisanych plamek (ryc. 5b, środkowy i dolny rząd), co sugeruje, że plamki mogą odpowiadać agregatom amyloidopodobnym utworzonym w starzejących się koacerwatach płynnych.
WF 25 µM αS przy różnych czasach inkubacji i wysokościach ogniskowych (z, odległość od niezwiązanego dna) w obecności 25 µM Tau441 (1 µM αS znakowany AF488 i Tau441 znakowany Atto647N) w studzience płytki mikroskopowej z buforem LLPS) .Niezależnie powtórzono sześć eksperymentów z podobnymi wynikami.b Obraz mikroskopowy CF 25 µM αS w obecności 25 µM Tau441 (1 µM Tau441 znakowany Atto647N) i 12,5 µM tioflawiny-T (ThT).Ważone kropelki białka oraz osadzone tratwy i plamki białka pokazano odpowiednio w górnym i środkowym rzędzie.Dolny rząd pokazuje obrazy tratw i kropli z 3 niezależnych replik.Białe strzałki wskazują kropki ThT-dodatnie na obu panelach.Pasek skali dla wszystkich obrazów wynosi 20 µm.
Aby bardziej szczegółowo zbadać zmiany w sieci białek koacerwatu podczas przejścia z cieczy do ciała stałego, wykorzystaliśmy obrazowanie czasu życia fluorescencji (FLIM) i rezonansową mikroskopię transferu energii Förstera (FRET) (rysunek 6 i rysunki uzupełniające 8 i 9).Postawiliśmy hipotezę, że dojrzewanie koacerwatu warstwy w bardziej skondensowaną lub nawet stałą zagregowaną strukturę białkową prowadzi do bliższego kontaktu białka z przyłączoną do niego sondą fluorescencyjną, potencjalnie powodując efekt wygaszenia objawiający się skróceniem czasu życia sondy (τ) jak opisano wcześniej40.,41,42.Ponadto w przypadku podwójnie znakowanych próbek (odpowiednio AF488 i Atto647N jako barwniki donorowe i akceptorowe FRET) temu spadkowi τ może również towarzyszyć kondensacja koacerwatu i wzrost wydajności FRET(E) podczas LSPT.Monitorowaliśmy tworzenie się tratw i plamek w czasie w próbkach LLPS αS/Tau441 i αS/ΔNt-Tau (25 µM każdego białka w buforze LLPS zawierającym 1 µM AF488 znakowany αS i/lub Atto647N znakowany Tau441 lub ΔNt-Tau).Zaobserwowaliśmy ogólną tendencję polegającą na tym, że czas życia fluorescencji sond AF488 (τ488) i Atto647N (τ647N) nieznacznie spadł w miarę dojrzewania koacerwatów (ryc. 6 i ryc. Uzupełniająca 8c).Co ciekawe, zmiana ta została znacznie wzmocniona w przypadku kropek w tratwach (ryc. 6c), co wskazuje, że w kropkach nastąpiła dalsza kondensacja białek.Na poparcie tego nie zaobserwowano znaczącej zmiany w czasie życia fluorescencji dla kropelek αS / ΔNt-Tau starzonych przez 24 godziny (rysunek uzupełniający 8d), co sugeruje, że żelowanie kropel jest procesem odmiennym od plamienia i któremu nie towarzyszy znacząca reorganizacja molekularna w obrębie koacerwatów.Należy zauważyć, że kropki mają różne rozmiary i zmienną zawartość w αS, szczególnie dla układu αS / Tau441 (rysunek uzupełniający 8e).Spadkowi czasu życia fluorescencji punktowej towarzyszył wzrost intensywności, zwłaszcza dla Tau441 znakowanego Atto647N (rysunek uzupełniający 8a) i wyższe wydajności FRET zarówno dla systemów αS / Tau441, jak i αS / ΔNt-Tau, wskazując na dalszą kondensację w LLPS Pięć godzin po wyzwoleniu białka wewnątrz elektryczności statycznej uległy kondensacji.W porównaniu do αS/ΔNt-Tau zaobserwowaliśmy niższe wartości τ647N i nieco wyższe τ488 w plamkach αS/Tau441, czemu towarzyszyły niższe i bardziej niejednorodne wartości FRET.Być może może to być związane z faktem, że w układzie αS / Tau441 obserwowana i oczekiwana liczebność αS w agregatach jest bardziej niejednorodna, często substechiometryczna w porównaniu z Tau, ponieważ sam Tau441 może również ulegać LLPS i agregacji (rysunek uzupełniający 8e) .Jednakże stopień koalescencji kropel, tworzenia tratw i, co ważne, agregacji białek w płynnych koacerwatach jest maksymalny, gdy obecne są zarówno Tau441, jak i αS.
a Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej (FLIM) do końca życia αS/Tau441 i αS/ΔNt-Tau przy 25 µM każdego białka (1 µM αS znakowane AF488 i 1 µM Tau441 lub ΔNt-Tau znakowane Atto647N) w buforze LLPS.Kolumny przedstawiają reprezentatywne obrazy próbek LLPS przy różnych czasach dojrzewania (30 minut, 5 godzin i 24 godziny).Czerwona ramka pokazuje obszar zawierający plamki αS/Tau441.Żywotność jest pokazana jako kolorowe paski.Pasek skali = 20 µm dla wszystkich obrazów.b Powiększony obraz FLIM wybranego obszaru, pokazany w czerwonej ramce na panelu a.Przedziały życia pokazane są przy użyciu tej samej skali kolorów, co w panelu a.Pasek skali = 5 µm.c Histogramy przedstawiające AF488 (przyłączony do αS) lub Atto647N (przyłączony do Tau) dla różnych gatunków białek (kropelki-D-, tratwa-R- i plamka-P) zidentyfikowanych na obrazach FLIM zarejestrowanych dla αS-) rozkłady czasu życia Tau441 i Próbki koacerwatu αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI dla D, 29-44 ROI dla R i 21-51 ROI dla punktów).Wartości średnie i mediany są pokazane odpowiednio jako żółte kwadraty i czarne linie wewnątrz ramek.Dolna i górna granica prostokąta reprezentują odpowiednio pierwszy i trzeci kwartyl, a minimalne i maksymalne wartości w 1,5-krotnym zakresie międzykwartylowym (IQR) pokazano jako wąsy.Wartości odstające są pokazane jako czarne romby.Istotność statystyczną pomiędzy parami rozkładów określono za pomocą testu t dla dwóch prób, zakładając nierówne wariancje.Wartości p w dwustronnym teście t pokazano gwiazdkami dla każdej pary porównywanych danych (* wartość p > 0,01, ** wartość p > 0,001, *** wartość p > 0,0001, **** wartość p > 0,00001), ns Wskazuje na nieistotność (wartość p > 0,05).Dokładne wartości p podano w tabeli uzupełniającej 1, a oryginalne dane przedstawiono w postaci surowych plików danych.
Aby jeszcze bardziej wykazać amyloidowy charakter plamek/agregatów, niezabarwione próbki koacerwatu traktowaliśmy przez 24 godziny wysokimi stężeniami (1 M) NaCl, co spowodowało oddzielenie agregatów od koacerwatów białkowych.Kiedy obserwowano izolowane agregaty (tj. rozproszony roztwór agregatów) za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM), zaobserwowaliśmy głównie kulistą morfologię o regularnej wysokości około 15 nm, która ma tendencję do łączenia się w warunkach wysokiego stężenia soli, podobnie jak zachowanie typowych włókienek amyloidowych ze względu na silny efekt hydrofobowy na powierzchni (należy zauważyć, że włókienka mają zazwyczaj wysokość ~ 10 nm) (rysunek uzupełniający 10a).Co ciekawe, gdy izolowane agregaty inkubowano z ThT w standardowym teście fluorescencji ThT, zaobserwowaliśmy dramatyczny wzrost wydajności kwantowej fluorescencji ThT, porównywalny z obserwowanym, gdy barwnik inkubowano z typowymi włókienkami amyloidowymi αS (rysunek uzupełniający 10b), co sugeruje, że agregaty koacerwatu zawierają struktury podobne do amyloidu..W rzeczywistości agregaty były tolerancyjne na wysokie stężenia soli, ale wrażliwe na 4 M chlorek guanidyny (GdnHCl), jak typowe włókienka amyloidu (rysunek uzupełniający 10c).
Następnie przeanalizowaliśmy skład agregatów za pomocą fluorescencji pojedynczej cząsteczki, specyficznej spektroskopii korelacji fluorescencji/korelacji krzyżowej (FCS/FCCS) i analizy rozerwania detekcji zbieżności dwóch kolorów (TCCD).W tym celu wyizolowaliśmy agregaty powstałe po 24 godzinach inkubacji w 100 µl próbek LLPS zawierających αS i Tau441 (oba 25 µM) wraz z 1 µM αS znakowanym AF488 i 1 µM Tau441 znakowanym Atto647N.Rozcieńczyć powstały rozproszony roztwór agregatów do stanu monocząsteczkowego, stosując ten sam bufor wolny od PEG i 1 M NaCl (ten sam bufor, który jest używany do oddzielania agregatów od koacerwatu), aby zapobiec możliwym interakcjom elektrostatycznym pomiędzy LLPS i białkiem.Przykład trajektorii czasowej pojedynczej cząsteczki można zobaczyć na ryc. 7a.Analiza FCCS/FCS (korelacja krzyżowa, CC i autokorelacja, AC) wykazała, że ​​w próbkach występowały obficie agregaty zawierające αS i tau (patrz krzywa CC na ryc. 7b, lewy panel), a nadmiar resztkowego białka monomerycznego powstał jako wynik procesu rozcieńczania (patrz krzywe AC na rysunku 7b, lewy panel).Eksperymenty kontrolne przeprowadzone w tych samych warunkach roztworu z użyciem próbek zawierających wyłącznie białka monomeryczne nie wykazały żadnych krzywych CC, a krzywe AC dobrze pasują do jednoskładnikowego modelu dyfuzji (Równ. 4), w którym białka monomeryczne mają oczekiwane współczynniki dyfuzji (Rys. 7b ), prawy panel).Współczynnik dyfuzji zagregowanych cząstek jest mniejszy niż 1 µm2/s, a białek monomerycznych około 1 µm2/s.50–100 µm/s;wartości są podobne do wcześniej opublikowanych wartości dla sonikowanych włókienek amyloidowych αS i monomerycznego αS oddzielnie w podobnych warunkach roztworu44.Kiedy analizowaliśmy agregaty za pomocą analizy eksplozji TCCD (ryc. 7c, górny panel), odkryliśmy, że w każdym izolowanym agregacie (heteroagregat αS/Tau) około 60% wykrytych agregatów zawierało zarówno αS, jak i tau, około 30% zawierało tylko tau, tylko około 10% αS.Analiza stechiometryczna heteroagregatów αS/Tau wykazała, że ​​większość heteroagregatów była wzbogacona w tau (stechiometria poniżej 0,5, średnia liczba cząsteczek tau na agregat jest 4 razy większa niż cząsteczek αS), co jest zgodne z naszą pracą zaobserwowaną w FLIM in situ eksperymenty..Analiza FRET wykazała, że ​​agregaty te zawierały obydwa białka, choć rzeczywiste wartości FRET w tym przypadku nie mają większego znaczenia, gdyż rozkład fluoroforów w każdym agregacie był losowy ze względu na nadmiar nieznakowanego białka użytego w eksperymencie.Co ciekawe, kiedy przeprowadziliśmy tę samą analizę przy użyciu wariantu Tau z niedoborem dojrzałej agregacji amyloidu 45,46 (patrz dodatkowa ryc. 11a, b), zauważyliśmy, że chociaż agregacja elektrostatyczna αS była taka sama (uzupełniająca ryc. 11c, d), zdolność do tworzenia agregatów w obrębie koacerwatu została drastycznie zmniejszona, a FLIM wykrył kilka plamek w eksperymentach in situ, a dla izolowanych próbek agregatów zaobserwowano słabe krzywe korelacji krzyżowej.Jednakże w przypadku niewielkiej liczby wykrytych agregatów (tylko jedna dziesiąta Tau441) zaobserwowaliśmy, że każdy agregat był wzbogacony w αS niż ten wariant Tau, przy czym około 50% wykrytych agregatów zawierało tylko cząsteczki αS, a αS był w nadmiarze niejednorodny .agregaty (patrz dodatkowa ryc. 11e), w przeciwieństwie do heterogenicznych agregatów generowanych przez Tau441 (ryc. 6f).Wyniki tych eksperymentów wykazały, że chociaż sam αS jest zdolny do akumulacji tau w koacerwacie, zarodkowanie tau jest w tych warunkach korzystniejsze, a powstałe agregaty podobne do amyloidu mogą działać jako forma αS i tau.Jednakże, gdy utworzy się rdzeń bogaty w tau, heterotypowe interakcje między αS i tau są w agregatach preferowane w stosunku do homotypowych interakcji między cząsteczkami tau;obserwujemy również sieci białek w płynnych koacerwatach αS / tau.
a Reprezentatywne tymczasowe ślady fluorescencji pojedynczych cząsteczek izolowanych agregatów utworzonych w koacerwatach elektrostatycznych αS/Tau441.Impulsy odpowiadające koagregatom αS/Tau441 (błyski powyżej wskazanego progu) zaobserwowano w trzech kanałach detekcyjnych (emisja AF488 i Atto647N po wzbudzeniu bezpośrednim, linie niebieska i czerwona, emisja Atto647N po wzbudzeniu pośrednim), FRET, linia fioletowa).b Analiza FCS/FCCS próbki wyizolowanych agregatów αS/Tau441 uzyskanych z LLPS (lewy panel).Krzywe autokorelacji (AC) dla AF488 i Atto647N pokazano odpowiednio w kolorze niebieskim i czerwonym, a krzywe korelacji krzyżowej (CC) związane z agregatami zawierającymi oba barwniki pokazano w kolorze fioletowym.Krzywe AC odzwierciedlają obecność znakowanych monomerycznych i zagregowanych form białek, podczas gdy krzywe CC pokazują jedynie dyfuzję podwójnie znakowanych agregatów.Ta sama analiza, ale w tych samych warunkach roztworu, co w izolowanych plamach, próbki zawierające tylko monomeryczny αS i Tau441 pokazano jako kontrole w prawym panelu.c Fluorescencyjna analiza flash pojedynczych cząsteczek izolowanych agregatów utworzonych w koacerwatach elektrostatycznych αS/Tau441.Informacje dla każdego agregatu znalezionego w czterech różnych powtórzeniach (N = 152) wykreślono w funkcji ich stechiometrii, wartości S i wydajności FRET (górny panel, kolorowy pasek odzwierciedla występowanie).Można wyróżnić trzy typy agregatów: -agregaty tylko αS z S~1 i FRET~0, agregaty tylko Tau z S~0 i FRET~1 oraz agregaty heterogeniczne Tau/αS z pośrednimi S i FRET Oszacowania ilości obu białek markerowych wykrytych w każdym heterogenicznym agregacie (N = 100) pokazano na dolnym panelu (skala kolorów odzwierciedla występowanie).Surowe dane są dostarczane w postaci surowych plików danych.
Donoszono, że dojrzewanie lub starzenie się płynnych kondensatów białek w struktury żelowe lub stałe z upływem czasu ma związek z kilkoma fizjologicznymi funkcjami kondensatu47, a także z występowaniem choroby jako nieprawidłowego procesu poprzedzającego agregację amyloidu7,48,49. W tym przypadku szczegółowo badamy separację faz i zachowanie.LSPT αS w obecności losowych polikationów w kontrolowanym środowisku przy niskich stężeniach mikromolowych i w warunkach fizjologicznie istotnych (należy zauważyć, że obliczone stężenie fizjologiczne αS wynosi > 1 µM50), zgodnie z typowym termodynamicznym zachowaniem LPS.Odkryliśmy, że αS, który zawiera silnie ujemnie naładowany region C-końcowy w fizjologicznym pH, jest w stanie tworzyć bogate w białko kropelki w roztworze wodnym poprzez LLPS w obecności wysoce kationowych nieuporządkowanych peptydów, takich jak pLK lub Tau, w procesie elektrostatycznym złożona kondensacja w obecności makrocząsteczek agregujących.Proces ten może mieć istotne skutki w środowisku komórkowym, gdzie αS napotyka różne cząsteczki polikationowe związane z jego agregacją związaną z chorobą, zarówno in vitro, jak i in vivo51,52,53,54.
W wielu badaniach dynamikę białek w kropelkach uznano za jeden z kluczowych czynników determinujących proces dojrzewania55,56.W elektrostatycznych koacerwatach αS z polikationami proces dojrzewania najwyraźniej zależy od siły oddziaływań z polikationami, wartościowości i krotności tych oddziaływań.Teoria równowagi sugeruje, że stan równowagi dwóch stanów ciekłych oznaczałby obecność dużej kropelki bogatej w biopolimery, które napędzają LLPS57,58.Wzrost kropelek można osiągnąć poprzez dojrzewanie Ostwalda59, koalescencję60 lub zużycie wolnego monomeru w fazie rozproszonej61.W przypadku αS i Tau441, ΔNt-Tau lub pLK większość białka zatężono w kondensacie w warunkach stosowanych w tym badaniu.Jednakże, chociaż pełnowymiarowe kropelki tau szybko łączyły się po zwilżeniu powierzchni, koalescencja i zwilżanie kropel były trudne w przypadku ΔNt-Tau i pLK, co sugeruje szybką utratę właściwości cieczy w tych dwóch układach.Według naszej analizy FLIM-FRET starzone kropelki pLK i ΔNt-Tau wykazywały podobny stopień agregacji białek (podobny czas życia fluorescencji) jak oryginalne kropelki, co sugeruje, że pierwotna sieć białkowa została zachowana, choć bardziej sztywna.
Racjonalizujemy wyniki naszych eksperymentów w następującym modelu (rysunek 8).Początkowo tymczasowo utworzone kropelki są często sieciami białkowymi bez kompensacji elektrostatycznej, w związku z czym istnieją obszary braku równowagi ładunku, szczególnie na granicy faz kropel, w wyniku czego powstają kropelki o wysokim potencjale powierzchni elektrostatycznej.Aby skompensować ładunek (zjawisko powszechnie określane jako wyczerpanie wartościowości) i zminimalizować potencjał powierzchniowy kropelek, kropelki mogą zawierać nowe polipeptydy z fazy rozcieńczonej, reorganizować sieci białek w celu optymalizacji interakcji ładunek-ładunek i wchodzić w interakcję z innymi kropelkami.z powierzchniami (zwilżanie).Kropelki αS/pLK, ze względu na prostszą sieć białkową (tylko interakcje heterotypowe pomiędzy αS i pLK) i większe powinowactwo do oddziaływań białko-białko, wydają się być w stanie szybciej równoważyć ładunek kondensatu;w istocie zaobserwowaliśmy szybszą kinetykę białek w początkowo utworzonych koacerwatach αS/pLK niż w αS/Tau.Po wyczerpaniu wartościowości interakcje stają się mniej efemeryczne, a kropelki tracą swoje właściwości ciekłe i zamieniają się w żelowe, niepalne kropelki o niskim elektrostatycznym potencjale powierzchniowym (a zatem niezdolne do zwilżenia powierzchni).Natomiast kropelki αS/Tau są mniej skuteczne w optymalizacji równowagi ładunku kropel ze względu na bardziej złożone sieci białek (z interakcjami zarówno homotypowymi, jak i heterotypowymi) oraz słabszy charakter interakcji białek.Powoduje to, że kropelki zachowują się płynnie przez dłuższy czas i wykazują wysoki potencjał elektrostatyczny powierzchni, który ma tendencję do minimalizowania poprzez koalescencję i wzrost (minimalizując w ten sposób stosunek powierzchni do objętości kropelek) oraz przez zwilżanie hydrofilowej substancji chemicznej powierzchni.Tworzy to duże, skoncentrowane biblioteki białek, które zachowują właściwości płynu, ponieważ interakcje pozostają bardzo przejściowe ze względu na ciągłe poszukiwanie optymalizacji ładunku w sieci białkowej.Co ciekawe, skrócone na N-końcu formy Tau, w tym niektóre naturalnie występujące izoformy62, wykazują zachowanie pośrednie, przy czym niektóre koacerwaty starzeją się pod wpływem αS w długo żyjące żelopodobne kropelki, podczas gdy inne przekształcają się w duże ciekłe kondensaty.Ta dwoistość w dojrzewaniu elektrostatycznych koacerwatów αS jest zgodna z najnowszymi badaniami teoretycznymi i eksperymentalnymi LLPS, które zidentyfikowały korelację między zubożeniem wartościowości a przesiewaniem elektrostatycznym w kondensatach jako klucz do kontrolowania wielkości kondensatu i właściwości płynu.Mechanizm 58.61.
Schemat ten przedstawia przypuszczalną ścieżkę agregacji amyloidu dla αS i Tau441 poprzez LLPS i LSPT.Dzięki dodatkowym obszarom bogatym w anion (czerwony) i bogaty w kation (niebieski), koacerwaty elektrostatyczne αS i tau o zadowalającej wartościowości mają niższą energię powierzchniową, a zatem mniejszą koalescencję, co powoduje szybkie starzenie się kropelek.Uzyskuje się stabilny, niezaglomerowany stan żelu..Sytuacja ta jest bardzo korzystna w przypadku układu αS/pLK ze względu na jego większe powinowactwo i prostszą sieć interakcji między parami białek, co pozwala na szybkie przejście żelowe.Wręcz przeciwnie, kropelki o niezadowalającej wartościowości, a zatem obszary naładowane białkiem dostępne do interakcji, ułatwiają koacerwatowi stapianie się i zwilżanie powierzchni hydrofilowej w celu zmniejszenia jego wysokiej energii powierzchniowej.Ta sytuacja jest korzystna w przypadku koacerwatów αS/Tau441, które mają wielowartościową złożoną sieć składającą się ze słabych interakcji Tau-Tau i αS-Tau.Z kolei większe koacerwaty łatwiej zachowają swoje właściwości przypominające płyn, umożliwiając wystąpienie innych interakcji białko-białko.Ostatecznie w płynie koacerwatowym tworzą się heterogeniczne agregaty amyloidu zawierające zarówno αS, jak i tau, co może być powiązane z agregatami występującymi w ciałach inkluzyjnych, które są cechą charakterystyczną chorób neurodegeneracyjnych.
Duże, płynne struktury utworzone podczas dojrzewania αS/Tau441 w silnie zatłoczonym, ale dynamicznym środowisku białek oraz, w mniejszym stopniu, koacerwaty αS/ΔNt-Tau są idealnymi zbiornikami do zarodkowania agregacji białek.Rzeczywiście zaobserwowaliśmy tworzenie się stałych agregatów białkowych w tego typu koacerwatach białkowych, często zawierających zarówno αS, jak i tau.Pokazaliśmy, że te heteroagregaty są stabilizowane przez oddziaływania nieelektrostatyczne, są w stanie wiązać specyficzne dla amyloidu barwniki ThT w taki sam sposób, jak typowe włókienka amyloidu i rzeczywiście mają podobną odporność na różne wpływy.Wykazano, że agregaty αS/tau utworzone przez LLPS mają właściwości podobne do amyloidu.Rzeczywiście, dojrzały wariant Tau z niedoborem agregacji amyloidu jest znacząco upośledzony w tworzeniu tych heterogenicznych agregatów αS w ciekłym koacerwacie elektrostatycznym.Tworzenie agregatów αS/Tau441 zaobserwowano jedynie wewnątrz koacerwatów, które zachowały właściwości płynne i nigdy, jeżeli koacerwaty/kropelki nie osiągnęły stanu żelowego.W tym drugim przypadku zwiększona siła oddziaływań elektrostatycznych i w rezultacie sztywność sieci białkowej uniemożliwiają niezbędne przegrupowania konformacyjne białek w celu ustanowienia nowych oddziaływań białkowych niezbędnych do zarodkowania amyloidu.Można to jednak osiągnąć w przypadku bardziej elastycznych, płynnych koacerwatów, które z kolei z większym prawdopodobieństwem pozostaną płynne w miarę zwiększania się rozmiaru.
Fakt, że tworzenie agregatów w fazie skondensowanej jest lepsze w przypadku dużych kondensatów αS/Tau niż w małych kropelkach, które szybko żelują, podkreśla znaczenie identyfikacji czynników kontrolujących koalescencję kropel.Zatem nie tylko istnieje tendencja do rozdzielania faz, ale wielkość kondensatu musi być kontrolowana w celu prawidłowego funkcjonowania i zapobiegania chorobom58,61.Nasze wyniki podkreślają również znaczenie równowagi pomiędzy LLPS i LSPT dla systemu αS/Tau.Chociaż tworzenie kropelek może chronić przed agregacją amyloidu poprzez zmniejszenie ilości monomerów białkowych dostępnych w warunkach nasycenia, jak zaproponowano w innych systemach63,64, fuzja kropel przy dużych poziomach kropel może prowadzić do wewnętrznej agregacji białek poprzez powolne przegrupowania konformacyjne.sieci białkowe..
Ogólnie rzecz biorąc, nasze dane silnie podkreślają znaczenie spójnej wartościowości oraz zadowolonych/niezadowolonych interakcji w sieciach zrzutowych w kontekście LSPT.W szczególności pokazujemy, że kondensaty αS / Tau441 pełnej długości są w stanie skutecznie łączyć się i zarodkować, tworząc heteroagregaty podobne do amyloidu, które obejmują oba białka i proponują mechanizm molekularny oparty na naszych wynikach eksperymentalnych.Koagregacja dwóch białek w płynnym koacerwacie αS/Tau, którą tu opisujemy, może rzeczywiście być związana z kolokalizacją dwóch białek we wtrąceniach, które są cechami charakterystycznymi choroby i może przyczynić się do zrozumienia związku między LLPS i agregację amyloidu, torując drogę wysoce naładowanemu IDP w neurodegeneracji.
Monomeryczne mutanty WT-αS, cysteiny (Q24C-αS, N122C-αS) i warianty ΔCt-αS (Δ101-140) poddano ekspresji w E. coli i oczyszczono jak opisano wcześniej.Na wszystkich etapach oczyszczania mutantów cysteiny αS dodano 5 mM DTT, aby zapobiec tworzeniu się wiązań dwusiarczkowych.Izoforma Tau441 (plazmid uzyskany z Addgene #16316), wariant ΔNt-Tau (Δ1–150, uzyskany przez klonowanie IVA ze starterami CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) i wariant AggDef-Tau (Δ275–311, oczyszczony starterem GGCTC5) E. co kultury li były hodowano do OD600 = 0,6–0,7 w 37°C i 180 obr./min i indukowano ekspresję za pomocą IPTG przez 3 godziny w 37°C.Zbierz komórki przy 11500 xg przez 15 minut w temperaturze 4°C i przemyj buforem soli fizjologicznej zawierającym 150 mM NaCl.Zawiesić osad w buforze do lizy (20 ml na 1 l LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidyna 50 µM, kopeptyna 100 µM).Etap sonikacji przeprowadzono na lodzie z amplitudą 80% przez 10 impulsów (1 minuta włączenia, 1 minuta wyłączenia).Nie przekraczać 60 ml w jednym USG.Lizaty E. coli ogrzewano w temperaturze 95°C przez 20 minut, następnie ochłodzono na lodzie i wirowano przy 127 000 x g przez 40 minut.Sklarowany supernatant nałożono na membranę 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Wielka Brytania) i dializowano wobec 4 l buforu do dializy (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0,1 mM) przez 10 godzin.Kolumnę kationowymienną o pojemności 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) zrównoważono buforem równoważącym (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Lizat tau przesączono przez filtr PVDF 0,22 µm i wstrzyknięto do kolumny przy szybkości przepływu 1 ml/min.Elucję prowadzono stopniowo, tau eluowano 15–30% buforem do elucji (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Frakcje analizowano za pomocą SDS-PAGE, a wszelkie frakcje zawierające jeden prążek o oczekiwanej masie cząsteczkowej tau zatężono przy użyciu filtra wirówkowego 10 kDa i zastąpiono buforem zawierającym 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM i DTT 2 mM dla końcowe stężenie białka wynosiło 100 µM.Roztwór białka następnie przepuszczono przez filtr PVDF 0,22 µm, szybko zamrożono i przechowywano w temperaturze -80°C.Białko K18 zostało udostępnione dzięki uprzejmości prof. Alberto Boffi.Czystość preparatu wynosiła >95%, co potwierdzono za pomocą SDS-PAGE i MALDI-TOF/TOF.Różne cysteiny znakowano chemicznie maleimidem AlexaFluor488 (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) lub maleimidem TEMPOL (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).potwierdzono absorbancją i MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau i K18 znakowano natywnymi resztami cysteiny w pozycjach 191 i 322 przy użyciu Atto647N-maleimidu (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Niemcy) zgodnie z tą samą procedurą.Mapy ładunku netto na resztę dla αS i Tau441 wygenerowano przy użyciu CIDER66.
Stałą poli-L-lizynę (pLK DP 90-110 według NMR od dostawcy, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) rozpuszczono w 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 do 10 mM stężenie, proces sonikowany przez 5 minut w ultradźwiękowej łaźni wodnej i przechowywać w temperaturze -20°C.PEG-8, dekstran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) i FITC-dekstran-500 (Sigma-Aldrich, Sant Louis, MI, USA) są rozpuszczalne w wodzie i szeroko rozprowadzane w buforze LLPS.Dializa usuwa zanieczyszczające sole.Następnie przesączono je przez filtr strzykawkowy o wielkości porów 0,22 µm i obliczono ich stężenia za pomocą refraktometru (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).Próbki LLPS przygotowano w temperaturze pokojowej w następującej kolejności: bufor i wytłaczanie zmieszano i 1 mM tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(etano- kwas 1,2-diylodinitrylo)tetraoctowy (EDTA, karboksynt) i mieszanina 1% inhibitora proteazy (PMSF 100 mM, benzimid 1 mM, leupeptyna 5 µM).Następnie dodaje się αS i skondensowane polikationy (opcje pLK lub Tau).W eksperymentach z szeregami czasowymi tioflawiny-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK) należy przyjąć, że całkowite stężenie ThT wynosi połowę stężenia αS.Delikatnie, ale dokładnie wymieszaj próbki, aby zapewnić ich jednorodność.Stężenie każdego składnika zmieniało się w zależności od eksperymentu, jak opisano w części Wyniki.Azydek stosowano w stężeniu 0,02% (w/v), gdy czas trwania doświadczenia przekraczał 4 godziny.W przypadku wszystkich analiz z użyciem próbek LLPS przed analizą należy pozostawić mieszaninę do zrównoważenia na 5 minut.Do analizy rozpraszania światła 150 µl próbek naniesiono na niewiążące 96-dołkowe mikropłytki (µClear®, czarne, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) i przykryto folią samoprzylepną.LLP monitorowano mierząc absorbancję przy 350 nm w środku roztworu w czytniku płytek CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Niemcy).Doświadczenia przeprowadzono trzykrotnie w temperaturze 25°C, a błędy obliczono jako odchylenie standardowe od średniej.Fazę rozcieńczoną oznaczono ilościowo za pomocą wirowania próbki i analizy żelu SDS-PAGE, a frakcję αS w fazie rozcieńczonej i stężonej oznaczono ilościowo w różnych roztworach LLPS.Próbkę 100 µl LLPS zawierającą 1 µM αS znakowaną AF488 przygotowano przez dokładne wymieszanie, a następnie wirowanie przy 9600 x g przez 30 minut, po czym zwykle widoczny był osad.Górne 50 µl supernatantu wykorzystano do ilościowego oznaczenia białka przy użyciu żelu SDS-PAGE.Żele skanowano filtrami AF488 przy użyciu systemu obrazowania żelów ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Kalifornia, USA) lub barwiono barwnikiem Coomassie i wizualizowano za pomocą odpowiednich filtrów.Powstałe prążki analizowano przy użyciu programu ImageJ w wersji 1.53i (National Institutes of Health, USA).Doświadczenia przeprowadzono w dwóch powtórzeniach w dwóch różnych eksperymentach z podobnymi wynikami.
Zazwyczaj 150 µl próbek nanoszono na niewiążące 96-dołkowe mikropłytki i wizualizowano w temperaturze pokojowej na odwróconym mikroskopie Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy).Do eksperymentów punktowych stosowano również płytki µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Niemcy) lub 96-dołkowe mikropłytki polistyrenowe (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Jako źródła oświetlenia (odpowiednio do obrazowania BF/DIC i WF) zastosowano lampy halogenowe lub rtęciowo-metalohalogenkowe EL6000.W przypadku mikroskopii WF zastosowano obiektyw powietrzny o powiększeniu 40x (Leica Microsystems, Niemcy) w celu skupienia światła na próbce i jej zebrania.W przypadku próbek oznaczonych AF488 i ThT, wzbudzenie i emisja filtra za pomocą standardowych zestawów filtrów GFP, filtrów pasmowo-przepustowych wzbudzenia i emisji, odpowiednio filtrów środkowoprzepustowych 460–500 nm i 512–542 nm oraz zwierciadła dichroicznego 495 nm.Do próbek oznaczonych Atto647N zastosowano standardowy zestaw filtrów Cy5 z filtrami środkowoprzepustowymi wzbudzenia i emisji odpowiednio 628–40 nm i 692–40 nm oraz zwierciadłem dichroicznym 660 nm.W przypadku mikroskopii BF i DIC należy używać tego samego obiektywu do zbierania światła odbitego.Zebrane światło rejestrowano kamerą CCD Leica DFC7000 (Leica Microsystems, Niemcy).Czas ekspozycji wynosił 50 ms dla obrazowania mikroskopowego BF i DIC oraz 20-100 ms dla obrazowania mikroskopowego WF.Dla porównania czas ekspozycji dla wszystkich eksperymentów z ThT wynosił 100 ms.Przeprowadzono eksperymenty poklatkowe w celu wizualizacji koalescencji kropel, przy czym obrazy były zbierane co 100 ms przez kilka minut.Do analizy obrazu wykorzystano ImageJ (NIH, USA).Doświadczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach z podobnymi wynikami.
Do eksperymentów kolokalizacji, FRAP i rekonstrukcji 3D obrazy uzyskano na odwróconym mikroskopie konfokalnym Zeiss LSM 880 przy użyciu niebieskiej edycji ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Niemcy).Próbki o pojemności 50 µl nałożono na płytki µ-Slide Angiogenesis Petriego (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Niemcy), potraktowano polimerem hydrofilowym (ibiTreat) i umieszczono w obiektywie immersyjnym w oleju 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) na DIC).Obrazy uzyskano przy użyciu linii lasera argonowego o długości fali 458 nm, 488 nm i 633 nm o rozdzielczości 0,26 µm/piksel i czasie ekspozycji 8 µs/piksel dla okien detekcji wzbudzenia i emisji wynoszących 470–600 nm, 493–628 nm, a 638–755 nm wykorzystano odpowiednio do wizualizacji ThT, AF488 i Atto647N.W eksperymentach FRAP rejestrowano zdjęcia poklatkowe każdej próbki z szybkością 1 klatki na sekundę.Doświadczenia przeprowadzono w trzech powtórzeniach w temperaturze pokojowej z podobnymi wynikami.Wszystkie obrazy analizowano przy użyciu oprogramowania Zen 2 blue Edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Niemcy).Krzywe FRAP znormalizowano, wykreślono i dopasowano do danych dotyczących intensywności/czasu uzyskanych z obrazów przy użyciu Zen 2 i OriginPro 9.1.Krzywe odzysku dopasowano do modelu monowykładniczego, aby uwzględnić dyfuzję molekularną, z dodatkowym składnikiem wykładniczym, aby uwzględnić efekt wybielania poprzez akwizycję.Następnie obliczyliśmy D, stosując nominalny promień bielenia i wcześniej określony okres półtrwania odzyskiwania, jak w równaniu Kanga i in.Pokazano 5 35.
Pojedyncze warianty cysteinowe αS zsyntetyzowano z 4-hydroksy-2,2,6,6-tetrametylopiperydyno-N-oksylem (TEMPOL) w pozycjach 24 (TEMPOL-24-αS) i 122 (TEMPOL-122-αS), odpowiednio.Znakowanie spinowe W eksperymentach EPR stężenie αS ustawiono na 100 µM, a stężenie PEG na 15% (w/v).Dla różnych warunków agregacji stosunek αS:pLK wynosił 1:10, podczas gdy stosunek αS:ΔNt-Tau i αS:Tau441 utrzymywał się na poziomie 1:1.Do eksperymentów z miareczkowaniem wiązania bez stłoczenia, TEMPOL-122-αS utrzymywano na poziomie 50 µM, a polikationy miareczkowano w rosnących stężeniach, przygotowując każdy warunek osobno.Pomiary CW-EPR przeprowadzono przy użyciu spektrometru pasma X Bruker ELEXSYS E580 wyposażonego w rezonator Bruker ER4118 SPT-N1 pracującego w częstotliwości mikrofalowej (SHF) ~9,7 GHz.Temperaturę ustawiono na 25°C i kontrolowano za pomocą kriostatu na ciekły azot.Widma uzyskano w warunkach nienasyconych przy mocy MW 4 mW, amplitudzie modulacji 0,1 mT i częstotliwości modulacji 100 kHz.Intensywności widmowe normalizowano, aby uniknąć różnic w stężeniach wirowania pomiędzy próbkami i możliwej redukcji wirowania z powodu resztkowych stężeń środków redukujących w próbkach zawierających Tau441 lub ΔNt-Tau (obecnych w oryginalnych roztworach białek).Podane wartości g otrzymano w wyniku modelowania widmowego EPR wykonanego przy użyciu oprogramowania Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) zaimplementowanego w Matlab®67.Do modelowania danych wykorzystano jedno/dwuskładnikowe modele izotropowe.Po normalizacji wszystkich sygnałów obliczono reszty, odejmując każdą symulację od odpowiedniego widma eksperymentalnego.Do analizy miareczkowania wiązania wykorzystano względną intensywność trzeciego pasma do drugiego pasma znormalizowanego widma EPR (IIII/III) w celu monitorowania wiązania polikationów z αS.Aby oszacować stałą dysocjacji (Kd), uzyskaną krzywą dopasowano do przybliżonego modelu zakładającego n identycznych i niezależnych miejsc wiązania.
Doświadczenia ze spektroskopią NMR przeprowadzono przy użyciu spektrometru Bruker Neo 800 MHz (1H) NMR wyposażonego w kriosondę i gradient Z.Wszystkie doświadczenia przeprowadzono przy użyciu 130–207 µM αS i odpowiednich równoważników αS/ΔNt-Tau i pLK w 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7,4 i przeprowadzono w temperaturze 15°C.Aby monitorować LPS za pomocą NMR, do wstępnie zmieszanych próbek dodano 10% PEG.Wykres zaburzeń przesunięcia chemicznego (ryc. 1b) pokazuje średnie przesunięcia chemiczne 1H i 15N.Widma αS 2D1H-15N HSQC przypisano na podstawie poprzedniego przypisania (wpis BMRB nr 25227) i potwierdzono poprzez rejestrację i analizę widm 3D HNCA, HNCO i CBCAcoNH.Przesunięcia chemiczne 13Cα i 13Cβ obliczono w obecności ΔNt-Tau lub pLK w celu zmierzenia możliwych zmian w trendach struktury drugorzędowej w porównaniu z przesunięciami chemicznymi αS w czystej konformacji cewki losowej 68 (rysunek uzupełniający 5c).Szybkości R1ρ mierzono rejestrując eksperymenty hsqctretf3gpsi (uzyskane z biblioteki Bruker) z opóźnieniami 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 i 800 ms, a funkcje wykładnicze dostosowano do opóźnień intensywności szczytowej przy różnych razy, aby określić R1ρ i jego niepewność eksperymentalną.
Eksperymenty z dwukolorową mikroskopią fluorescencyjną z rozdzielczością czasową przeprowadzono na dostępnym w handlu fluorescencyjnym mikroskopie konfokalnym MT200 z rozdzielczością czasową (PicoQuant, Berlin, Niemcy) ze skorelowanym w czasie urządzeniem do zliczania pojedynczych fotonów (TCSPC).Głowica diody laserowej służy do impulsowego wzbudzenia z przeplotem (PIE), wiązka przechodzi przez falowód jednomodowy i jest dostrojona do mocy lasera od 10 do 100 nW dla linii lasera 481 nm i 637 nm mierzonych za zwierciadłem dichroicznym.Zapewnia to optymalną szybkość zliczania fotonów, unikając skutków aliasingu fotonów, fotowybielania i nasycenia.Szkiełka nakrywkowe lub płytki do angiogenezy μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Niemcy) umieszczono bezpośrednio w wodzie zanurzeniowej nad soczewką Super Apochromat 60x NA 1.2 z kołnierzem korekcyjnym (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Jako główny rozdzielacz wiązki zastosowano zwierciadło dichroiczne 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA).Promieniowanie nieskoncentrowane blokowane jest przez otwór o średnicy 50 mikronów, następnie promieniowanie skupione rozdzielane jest na 2 ścieżki detekcji za pomocą rozdzielacza wiązki 50/50.Przed detektorem zastosowano filtry emisyjne środkowoprzepustowe (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 dla barwnika zielonego (AF488) i 690/70 dla barwnika czerwonego (Atto647N).Jako detektory wykorzystano jednofotonowe diody lawinowe (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Włochy).Zarówno gromadzenie danych, jak i analizę przeprowadzono przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Berlin, Niemcy).
Pięćdziesiąt mikrolitrów próbek LLPS naniesiono na studzienki angiogenezy μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Niemcy).Uzyskane obrazy są ogniskowane do 20 µm nad dnem odwiertu, aby zapewnić optymalną obiektywną odległość roboczą dla zawieszonych kropelek i do ~1 µm dla tratw i kropek, z rozdzielczością osiową co najmniej 0,25 µm/piksel i czasem opóźnienia 400 µs/piksel.Wybierz dane, stosując próg intensywności w oparciu o średnią intensywność sygnału tła (PBG, średnia + 2σ) dla każdego kanału, tak aby wybrane zostały tylko kropelki, tratwy lub plamki ciekłego białka, odfiltrowując wszelkie możliwe pochodzenie z fazy rozproszonej.Aby przeanalizować długość życia każdego gatunku (τ) każdego kanału (zielony, „g” dla AF488 i czerwony, „r” dla Atto647N), wybraliśmy obszary zainteresowania (ROI) zawierające kropelki, tratwy lub plamki (rysunek uzupełniający 1 ).8b) i wyprowadził je, dopasowując ich rozpad w czasie życia (odpowiednio τD, τR i τP dla kropelek, tratw lub plam, patrz dodatkowa ryc. 8c) w każdym kanale, stosując analizę dopasowania ogona i dwuskładnikowy model rozpadu.Średnie τ z τ .Z analizy wykluczono ROI, które wytworzyły zbyt mało fotonów dla dopasowania wielowykładniczego.Zastosowana wartość odcięcia wynosiła <104 fotony dla tratw i kropek oraz 103 dla kropli.Krople mają niższy próg, ponieważ trudno jest uzyskać krzywe zaniku o wyższych wartościach intensywności, gdyż kropelki w polu obrazu są zwykle mniejsze i mniej liczne.Do analizy odrzucono także ROI z liczbą fotonów powyżej limitu akumulacji fotonów (ustawionego na >500 zliczeń/piksel).Dopasuj krzywą zaniku intensywności uzyskaną z obszaru zainteresowania do intensywności wynoszącej 90% wartości maksymalnej (nieco po maksymalnej intensywności zaniku) od początku okresu użytkowania, aby zapewnić minimalne zakłócenia IRF przy jednoczesnym zachowaniu tego samego dla wszystkich zaników intensywności ustawienia Względne okno czasowe Analizowano 25 do 50 ROI dla tratw i plamek oraz 15-25 ROI dla kropli, obrazy wybrane z więcej niż 4 powtórzeń zarejestrowanych z co najmniej 3 niezależnych eksperymentów.Do oceny różnic statystycznych między gatunkami lub między układami koacerwatów zastosowano dwustronny test t.W przypadku analizy czasu życia (τ) piksel po pikselu obliczono całkowite tłumienie czasu życia w polu dla każdego kanału i przeprowadzono przybliżenie 2/3-składnikowego modelu tłumienia wykładniczego.Następnie dopasowano tłumienie czasu życia dla każdego piksela, korzystając z wcześniej obliczonych wartości τ, w wyniku czego otrzymano pseudokolorowy obraz dopasowania FLIM.Zakres czasu życia dopasowania ogona był taki sam na wszystkich obrazach tego samego kanału, a każdy rozpad wytworzył wystarczającą ilość fotonów, aby zapewnić niezawodne dopasowanie.Do analizy FRET wybrano piksele, stosując niższy próg intensywności wynoszący 100 fotonów, co uśredniało sygnał tła (FBG) wynoszący 11 fotonów.Intensywność fluorescencji każdego kanału korygowano eksperymentalnie wyznaczonymi współczynnikami korekcyjnymi: przesłuch widmowy 69 α wynosił 0,004, bezpośrednie wzbudzenie β wynosiło 0,0305, skuteczność detekcji γ wynosiła 0,517.Następnie oblicza się efektywność FRET na poziomie piksela, korzystając z następującego równania:
gdzie FDD to intensywność fluorescencji obserwowana w kanale donorowym (zielonym), FDA to intensywność fluorescencji obserwowana w kanale akceptorowym (czerwonym) przy wzbudzeniu pośrednim, a FAA to intensywność fluorescencji obserwowana w kanale akceptorowym (czerwonym) przy wzbudzeniu bezpośrednim ( CIASTO).W kanale obserwuje się impulsy intensywności fluorescencji).
Umieścić 100 µl roztworów reakcyjnych LLPS zawierających 25 µM nieznakowanego monomerycznego Tau441 (z 25 µM αS lub bez) w buforze LLPS (uzupełnionym jak powyżej) na niewiążących 96-dołkowych mikropłytkach pokrytych folią samoprzylepną, a tworzenie kropel sprawdzono za pomocą mikroskopii WF po zrównoważenie.w ciągu 10 minutPo 48 godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej potwierdzono obecność tratw białkowych i plam.Następnie ostrożnie usuń płyn nad tratwami ze dołków, następnie dodaj 50 l buforu do dysocjacji (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) i inkubuj przez 10 minut.Wysokie stężenie soli gwarantuje, że LLPS nie powtórzy się z powodu resztkowego PEG, a możliwe zespoły białkowe utworzone jedynie w wyniku oddziaływań elektrostatycznych zostaną zdemontowane.Następnie ostrożnie zeskrobano dno dołka końcówką mikropipety i powstały roztwór przeniesiono do pustego dołka obserwacyjnego.Po inkubacji próbek z 50 µM ThT przez 1 godzinę, obecność izolowanych plamek sprawdzono za pomocą mikroskopii WF.Przygotować sonikowane włókienka αS poprzez inkubację 300 µl 70-µM roztworu αS w PBS o pH 7,4, azydku sodu 0,01% w temperaturze 37°C i 200 obr./min na wytrząsarce orbitalnej przez 7 dni.Roztwór następnie odwirowano przy 9600 x g przez 30 min, osad ponownie zawieszono w PBS o pH 7,4 i poddano sonikacji (1 min, 50% cykl, 80% amplituda w sonikatorze Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, USA) próbki włókienek ze stosunkowo równomiernym rozkładem wielkości małych włókienek.
Analizę FCS/FCCS i wykrywanie koincydencji dwóch kolorów (TCCD) przeprowadzono na tym samym fluorescencyjnym mikroskopie konfokalnym z rozdzielczością czasową MT200 (Pico-Quant, Berlin, Niemcy), który był używany w eksperymentach mikroskopowych FLIM-FRET przy użyciu trybu PIE.Do mocy lasera w tych eksperymentach dodano 6,0 µW (481 nm) i 6,2 µW (637 nm).Wybrano kombinację tych mocy lasera, aby uzyskać podobną jasność zastosowanych par fluoroforów, osiągając jednocześnie optymalne współczynniki zliczania i unikając fotowybielania i nasycenia.Zarówno zbieranie danych, jak i analizę przeprowadzono przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania SymphoTime64 w wersji 2.3 (PicoQuant, Berlin, Niemcy).
Próbki izolowanych agregatów αS/Tau otrzymanych przy użyciu LLPS rozcieńcza się w buforze izolacyjnym do odpowiedniego stężenia jednocząsteczkowego (zwykle rozcieńczenia 1:500, ponieważ agregaty mają już niskie stężenia po izolacji z próbek koacerwatu).Próbki nanoszono bezpośrednio na szkiełka nakrywkowe (Corning, USA) wstępnie pokryte roztworem BSA o stężeniu 1 mg/ml.
Do analizy PIE-smFRET w kanałach zielonym i czerwonym zastosowano niższy próg intensywności wynoszący 25 fotonów w celu odfiltrowania sygnałów o niskiej intensywności spowodowanych zdarzeniami monomerycznymi (należy zauważyć, że monomery przewyższają liczbę zagregowanych próbek w porównaniu z izolowanymi agregatami).Próg ten obliczono jako pięciokrotność średniego natężenia monomerycznego αS uzyskanego z analizy próbek czystych monomerów w celu konkretnego wybrania agregatów do analizy.Obwód napędowy PIE wraz z akwizycją danych TSCPC umożliwił zastosowanie filtra ważącego na cały okres eksploatacji, który pomaga eliminować przesłuchy tła i widma.Intensywność rozbłysku wybraną przy użyciu powyższych progów skorygowano przy użyciu średniego sygnału tła określonego na podstawie histogramów występowania w funkcji intensywności/bin próbek zawierających wyłącznie bufor.Impulsy związane z dużymi agregatami zazwyczaj zajmują kilka kolejnych przedziałów w zapisie czasowym (ustawionym na 1 ms).W tych przypadkach wybrano kosz o maksymalnej wytrzymałości.Do analizy FRET i analizy stechiometrycznej wykorzystano teoretycznie wyznaczony współczynnik gamma γ (0,517).Przesłuch widmowy i udział bezpośredniego wzbudzenia są znikome (określone eksperymentalnie) przy zastosowanej mocy lasera wzbudzenia.Wydajność i stechiometrię FRET podczas eksplozji oblicza się w następujący sposób.