Składnik chemiczny zwijanych rurek ze stali nierdzewnej 347, identyfikacja nowych białek opiekuńczych ludzkiego antygenu leukocytów A (HLA-A) reagujących na interferon za pomocą usieciowanej spektrometrii mas (CLMS)

Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Używasz wersji przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS.Aby uzyskać najlepszą jakość, zalecamy użycie zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer).Dodatkowo, aby zapewnić bieżące wsparcie, pokazujemy witrynę bez stylów i JavaScript.
Suwaki pokazujące trzy artykuły na slajd.Użyj przycisków Wstecz i Dalej, aby poruszać się po slajdach, lub przycisków kontrolera slajdów na końcu, aby poruszać się po poszczególnych slajdach.

Opis produktu

Rury cewkowe ze stali nierdzewnej 347L, gatunek stali: SS347L

System sygnalizacji interferonu indukuje silną odpowiedź cytokin na szeroki zakres patogennych i wewnętrznych sygnałów patologicznych ze środowiska, co skutkuje indukcją podzbiorów białek indukowanych interferonem.Zastosowaliśmy spektrometrię mas z sieciowaniem za pośrednictwem DSS (CLMS) w celu wykrycia nowych interakcji białko-białko w domenie białek indukowanych interferonem.Oprócz oczekiwanych białek indukowanych interferonem, zidentyfikowaliśmy także nowe międzycząsteczkowe i wewnątrzcząsteczkowe usieciowane addukty kanonicznych białek indukowanych interferonem, takich jak MX1, USP18, OAS3 i STAT1.Skoncentrowaliśmy się na ortogonalnej walidacji nowego zestawu indukowanych interferonem sieci białkowych utworzonych przez białka HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) przy użyciu koimmunoprecypitacji i ich dalszych badaniach z wykorzystaniem modelowania dynamiki molekularnej.Modelowanie dynamiki konformacyjnej kompleksu białkowego ujawniło kilka miejsc interakcji, które odzwierciedlają interakcje zidentyfikowane w ustaleniach CLMS.Wspólnie prezentujemy badanie pilotażowe CLMS w celu zidentyfikowania nowych kompleksów sygnalizacyjnych indukowanych przez interferon i z niecierpliwością czekamy na szersze zastosowanie CLMS do identyfikacji nowej dynamiki interakcji białek w mikrośrodowisku guza.
Zanim rozpocznie się adaptacyjna odpowiedź immunologiczna, wrodzony system obronny gospodarza wywołuje odpowiedź przeciwdrobnoustrojową, w której pośredniczy rodzina wydzielanych alfa-helikalnych cytokin zwanych interferonami (IFN).Klasy IFN typu I IFNα i IFNβ aktywują odpowiedzi komórkowe, w tym stany przeciwwirusowe, proapoptotyczne, prozapalne i antyproliferacyjne.U ludzi znanych jest 13 podtypów IFNα, wszystkie skupione na chromosomie 91. Co zaskakujące, do użytku klinicznego badano tylko IFNα2.Ostatnio szczególną uwagę poświęcono badaniom nad innymi podtypami IFNα.Niedawne badania wykazały, że IFNα14 jest jedną z najskuteczniejszych izoform ograniczających replikację HBV2 i HIV-13,4 w porównaniu z kanonicznym podtypem IFNα2.
Ustalono, że aktywowane kompleksy receptorów interferonu typu I (IFNAR1 i IFNAR2) wyzwalają kaskadę przekazywania sygnału, w której pośredniczą kinazy Janus TYK2 i JAK15,6.Te kinazy Janus fosforylują przetworniki sygnału i aktywatory białek transkrypcyjnych (STAT1 i STAT2) na resztach tyrozyny, aby zapoczątkować heterodimeryzację za pośrednictwem domeny SH26.Następnie IRF9 wiąże heterodimery STAT, tworząc trimeryczny kompleks genu czynnika 3 stymulowanego IFN (ISGF3), który przemieszcza się do jądra i indukuje transkrypcję ponad 2000 genów stymulowanych interferonem (ISG)5,6,7,8.
ISG stanowią szkielet wrodzonego układu odpornościowego, szczególnie w odpowiedzi na atak wirusowy.Jako pierwsza linia obrony przed infekcją wirusową, komórki szybko wykorzystują rozległe interakcje białek komórkowych z szerokim zakresem aktywności biologicznej.Białka te obejmują receptory rozpoznające wzorce, cząsteczki sygnalizacyjne, czynniki transkrypcyjne i białka o bezpośrednich funkcjach przeciwwirusowych, a także negatywne regulatory odpowiedzi immunologicznych9.Wiele informacji na temat aktywności ISG pochodzi z badań funkcjonalnych wykorzystujących badania przesiewowe nadekspresji10,11 lub techniki wyciszania genów (siRNA, RNAi i CRISPR)12,13, w których dochodzi do ekspresji lub hamowania poszczególnych ISG, a ich aktywność jest testowana na różnych wirusach.Chociaż w badaniach tych określono właściwości przeciwwirusowe poszczególnych ISG, podstawowe mechanizmy molekularne każdego ISG pozostają w dużej mierze nieznane.Ogólnie przyjmuje się, że wiele białek oddziałuje z jedną lub większą liczbą cytokin, aby zapewnić pełną aktywność, więc albo ISG oddziałują bezpośrednio, albo w ich interakcjach pośredniczą białka komórkowe.Na przykład, niedawne badanie proteomiki fotousieciowanej zidentyfikowało ATPazę VCP/p97 jako głównego partnera interakcji IFITM3, którego hamowanie prowadzi do defektów w sortowaniu lizosomalnym, obrocie i kotransporcie IFITM3 z cząsteczkami wirusa 14 .Stosując immunoprecypitację, zidentyfikowaliśmy VAPA, białko związane z pęcherzykami, jako partnera interakcji z IFITM1/2/3, który pośredniczy w dojrzewaniu wirusa za pośrednictwem cholesterolu, co zostało potwierdzone w innym badaniu z wykorzystaniem drożdżowego układu dwuhybrydowego.Wsparcie naukowe 15, 16.
Podstawowym procesem biologicznym zaangażowanym w hamowanie infekcji i transformacji nowotworowej jest prezentacja antygenu, w której pośredniczą cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC).Peptydy (o długości 8-12 aminokwasów) z rozciętych, przedwcześnie zakończonych lub nieprawidłowo sfałdowanych białek ładuje się do heterodimeru MHC-I (składającego się z ciężkich i lekkich łańcuchów MHC-I, zwanych β-2-mikroglobuliną; β2M) 17,18 .Powstałe stabilne trimery MHC-I są transportowane na powierzchnię komórki, gdzie prezentują wewnątrzkomórkowe peptydy komórkom T CD8+ (komórkom T cytotoksycznym)17.Limfocyty T rozpoznają i niszczą te patogeny oraz komórki niosące antygen specyficzny dla nowotworu.W rezultacie patogeny i komórki nowotworowe często hamują proces prezentacji antygenu, aby uniknąć nadzoru immunologicznego.Ponadto poziom MHC-I jest obniżony w 40–90% ludzkich nowotworów, co często wiąże się z gorszym rokowaniem19.
Geny biorące udział w reagowaniu na patogeny muszą szybko przełączać się między stanem spoczynku a stanem aktywnej transkrypcji.Dlatego też przypuszcza się, że kilka białek komórkowych bierze udział w odpowiedzi na wysokie zapotrzebowanie na IFN w krótkich okresach czasu, włączając w to przebudowę i modyfikację chromatyny promotorowej 20,21.Większość badań skupiała się na identyfikacji poszczególnych partnerów białkowych ISG w obecności IFN.Kilka badań proteomicznych i transkryptomicznych w modelowych układach komórkowych wyjaśniło wpływ IFN na krajobraz komórkowy.Jednakże pomimo rosnącego zrozumienia dynamiki wywoływanej przez interferony, nadal niewiele wiemy na temat zaangażowania ISG.Rozważając złożoność i zależną od czasu dynamikę sygnalizacji interferonu, pojawiają się dwa pytania: (i) czy możliwa jest stabilizacja i pułapka kompleksów wielobiałkowych zaangażowanych w szybką sygnalizację oraz (ii) czy te interakcje można zmapować w przestrzeni 3D?
Aby rozwiązać te problemy, wdrożyliśmy chemiczne sieciowanie za pośrednictwem suberatu diukcynoimidu (DSS) w połączeniu ze spektrometrią mas (CLMS) w celu zbadania sieci interakcji białek indukowanej IFNα i jej dynamiki.DSS dodaje wiązania kowalencyjne pomiędzy proksymalnymi resztami białek i/lub kompleksami białek in vivo.Późniejsza analiza MS ujawnia specyficzne miejsca sieciowania, które odzwierciedlają przestrzenną bliskość regionów w obrębie konkretnego białka, zwane wiązaniami wewnętrznymi lub podjednostkami w kompleksach białkowych, zwanymi wzajemnymi powiązaniami.Stosując to podejście, zidentyfikowaliśmy kilka nowych kompleksów białko-białko, a także sieci interakcji wielobiałkowych indukowanych interferonem.Poprzez dalsze testowanie podzbioru tych nowych interakcji wykazaliśmy, że H2BFS (FS typu histonowego H2B; dalej określany jako H2B) i MDN1 działają jako partnerzy wiążący dla HLA-A.
Komórki Flo-1 są jednym z najlepiej znanych modeli gruczolakoraka przełyku in vitro, ponieważ naśladują kluczowe cechy nowotworów przełyku22,23.Jednakże nie wszystkie nowotwory są immunogenne i aby określić, czy komórki Flo-1 odpowiadają na leczenie interferonem, traktowaliśmy komórki Flo-1 10 ng/ml IFNα przez 72 godziny.Komórki Flo-1 wykazywały wczesną indukcję pSTAT1 i IRF1, rozpoczynającą się 2 godziny po leczeniu i trwającą przez 72 godziny, z zależnym od czasu spadkiem stacjonarnych poziomów IRF1 (Figura 1A).Stwierdzono, że ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 i ISG15) są silnie indukowane po 6 godzinach, naśladując klasyczne odpowiedzi środkowej i późnej fazy na IFNα (ryc. 1A).Łącznie dane te sugerują, że ten model komórkowy można wykorzystać do badania odpowiedzi na interferon.
Zróżnicowane odpowiedzi ekspresji białek w komórkach Flo-1 po leczeniu IFNα.(A) Ekspresję białka w komórkach Flo-1 traktowanych 10 ng/ml IFNα przez 2, 6, 24, 48 i 72 godziny analizowano metodą immunoblotu przy użyciu wskazanych przeciwciał ISG.(B) Żele SDS-PAGE z ekstraktów całych komórek barwione błękitem Coomassie po usieciowaniu za pomocą DSS dla wskazanych czasów i stężeń.(C) Reprezentatywny immunoblot badany z przeciwciałem p53(DO-1) z tych samych próbek w celu oceny stopnia usieciowania białek.
Aby uchwycić krajobraz interakcji białek in situ, zastosowaliśmy DSS, szeroko stosowany środek sieciujący ze względu na jego wysoką przepuszczalność błony i stosunkowo krótki czas reakcji.Krótszy czas reakcji pomaga zapobiegać tworzeniu się dużych agregatów usieciowanych białek, utrzymując w ten sposób stabilność środka sieciującego.Aby określić optymalne stężenie DSS i uniknąć nadmiernego sieciowania, najpierw wystawiliśmy komórki na działanie 5, 2,5 i 1 mM DSS przez odpowiednio 5, 10, 5 i 30 minut i analizowaliśmy lizaty za pomocą SDS-PAGE barwionego Coomassie (dane nie pokazane).Lizaty komórkowe wydają się być silnie usieciowane przy najniższym stężeniu i w najkrótszym czasie.Dlatego też DSS miareczkowano do 1, 0,5 i 0,1 mM w ciągu 5 minut (ryc. 1B).Optymalne sieciowanie obserwowano przy 0,5 mM DSS przez 5 minut i takie warunki wybrano dla komórek traktowanych IFNα.Ponadto Figura 1C przedstawia analizę Western przeprowadzoną przy użyciu przeciwciała p53 (DO-1) w celu oceny stopnia usieciowania białka.
Komórki Flo-1 traktowano 10 ng/ml IFNα przez 24 godziny przed dodaniem środka sieciującego.Usieciowane komórki poddano następnie lizie metodą dwuetapowej proteolizy, a białka poddano obróbce metodą FASP (ryc. 2)24,25.Usieciowane peptydy trypsynowe analizowano metodą spektrometrii mas (ryc. 2).Następnie widma MS/MS dopasowuje się do sekwencji białka i oznacza ilościowo za pomocą MaxQuant26,27.Usieciowane peptydy zidentyfikowano na podstawie uzyskanych widm przy użyciu programu SIM-XL, a poszczególne związki połączono w złożoną sieć przy użyciu potoków oprogramowania obliczeniowego open source xQuest28 i SIM-XL29 (ryc. 2).SIM-XL identyfikuje interakcje białko-białko, łańcuchy wewnętrzne i pojedyncze łańcuchy w prostych lub złożonych mieszaninach białek i zapewnia skrypty do wizualizacji interakcji w strukturach białkowych.Ponadto klasyfikuje każde powiązanie jako punktację identyfikacyjną zgodnie z jakością widma MS/MS29.Zidentyfikowano kilka wysoce niezawodnych interakcji i kompleksów białko-białko, a nowy zestaw interakcji poddano dalszym badaniom przy użyciu koimmunoprecypitacji i zmian konformacyjnych kompleksów przy użyciu modelowania dynamiki molekularnej (MD) (ryc. 2) 30, 31.
Schematyczny przegląd metody CLMS.Komórki Flo-1 traktowano 10 ng/ml IFNα przez 24 godziny, a następnie przeprowadzono sieciowanie białek in situ przy użyciu DSS, a następnie lizę komórek i trypsynizację.Usieciowane próbki analizowano przy użyciu spektrometru masowego Orbitrap, a następnie pobierano próbki pod kątem fragmentacji prekursorów peptydowych podczas LC-MS/MS.Na podstawie otrzymanych widm zidentyfikowano dwa połączone peptydy za pomocą maszyny do rozpoznawania widma programu Crosslinked Peptides (SIM-XL), a wszystkie związki połączono w złożoną sieć za pomocą potoków obliczeniowych.Odfiltruj interakcje o niskim poziomie pewności w oparciu o współczynnik wyników fałszywie dodatnich (FDR).Potwierdzono ponadto kilka nowych interakcji białko-białko o wysokiej wierności za pomocą koimmunoprecypitacji, a zmiany konformacyjne w kompleksach zbadano za pomocą modelowania dynamiki molekularnej (MD).
W sumie wykryto ~ 30 500 i ~ 28 500 peptydów przy użyciu MaxQuant odpowiednio w niestymulowanych i stymulowanych próbkach IFNα (tabela uzupełniająca S1, ryc. 3A).Rozkład długości peptydów w obu przypadkach wykazywał większy udział większych peptydów, co wskazuje na obecność peptydów usieciowanych (ryc. 3B, C).Ponadto w próbkach traktowanych IFNα występowała większa część większych peptydów w zakresie 40–55 (ryc. 3C).Mapowanie białek względem intensywności log2 wykazało, że klasyczne białka stymulowane interferonem były najliczniejsze w porównaniu z próbkami nietraktowanymi, w tym MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 i HLA-F (Figura 3D).Analiza szlaków dla białek ponad trzykrotnie wzbogaconych w odpowiedzi na leczenie IFNα przy użyciu bazy danych szlaków Reactome wykazała, że ​​prezentacja i przetwarzanie antygenu za pośrednictwem MHC-I była najbardziej dominującym szlakiem (Figura 3E).Zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami, wśród aktywowanych szlaków znalazły się odpowiedzi przeciwwirusowe, w których pośredniczą OAS i ISG15, a także IFNα/β i sygnalizacja cytokin.Ponadto, na podstawie pierwotnie uzyskanych widm MS/MS przy użyciu SIM-XL, zidentyfikowano specyficzne dla lizyny i seryny wiązania krzyżowe białek.Niedawne badanie wykazało 104 ISG obejmujące 20 wirusów z 9 klas wirusów, na podstawie metaanalizy poszczególnych badań nadekspresji ISG w 5 typach komórek9.Aby jednak przezwyciężyć ograniczenia obliczeniowe związane z przeszukiwaniem dużych zbiorów danych, zaczęliśmy od mniejszego zbioru danych, aby zbadać możliwe interakcje między listą genów IRDS podaną przez Padaria i wsp., z których większość to ISG.
Identyfikacja usieciowanych białek o zróżnicowanej ekspresji w odpowiedzi na IFNα (dane uzyskane z MaxQuant).(A) Diagram Venna przedstawiający liczbę powszechnych i wyłącznych peptydów zidentyfikowanych w próbkach Flo-1 traktowanych i nietraktowanych IFNα14.Rozkład długości peptydów w próbkach usieciowanych nietraktowanych (B) i traktowanych IFNα (C).(D) Mapa cieplna przedstawiająca log2 (intensywność LFQ) pomiędzy komórkami Flo-1 nietraktowanymi i traktowanymi IFNα14.Lewy panel pokazuje białka najaktywniej aktywowane w obecności IFNα.(E) Histogram przedstawiający 20 głównych ścieżek wzbogacania po leczeniu IFNα.W bazie danych szlaków Reactome przeanalizowano ponad czterokrotne zmiany w białkach reagujących na IFNα o zwiększonej ekspresji.
Stymulacja ISG za pośrednictwem interferonu jest dobrze udokumentowana, ale na poziomie molekularnym słabo poznano, w jaki sposób białka te osiągają swój punkt kulminacyjny w szerokim zakresie funkcji biologicznych.Zbadaliśmy interakcje białek z wysokim stopniem pewności między znanymi ISG.Co ciekawe, zidentyfikowaliśmy sieć obejmującą białka MX1, USP18, ROBO1, OAS3 i STAT1, które tworzą duży kompleks w odpowiedzi na leczenie IFNα (ryc. 4, tabela S2) 32,33,34.Co najważniejsze, interakcje te stwierdzono we wszystkich trzech powtórzeniach traktowanych IFNα i nie stwierdzono ich w próbkach nietraktowanych, co sugeruje, że powstały one specyficznie w odpowiedzi na leczenie IFNα.Wiadomo, że STAT1 reguluje transkrypcyjnie ekspresję tych ISG, ale nie badano jego interakcji z ISG na poziomie białka.Struktura krystaliczna STAT1 wykazała, że ​​jego domena helikalna (CCD) nie bierze udziału w interakcji z DNA lub protomerami podczas tworzenia dimerów35.Te α-helisy tworzą strukturę spiralnej helisy, która zapewnia przeważnie hydrofilowy obszar powierzchni, w którym mogą zachodzić interakcje 35 .W naszych danych CLMS zaobserwowaliśmy, że większość interakcji ze STAT1 zachodziła w domenie SH2 poprzedzającej CCD, domenie łącznikowej lub ogonie C-końcowym (reszty 700-708) (Rysunek 4A).Z poprzedniego badania wynika, że ​​USP18 wiąże się z CCD i domeną wiążącą DNA (DBD) STAT2 i jest przyłączany do podjednostki receptora interferonu typu I IFNAR2, aby pośredniczyć w hamowaniu sygnalizacji interferonu typu I 24 .Nasze dane pokazały również, że domena katalityczna USP18 oddziałuje z DBD STAT1 (ryc. 4A, D), co sugeruje, że zarówno STAT1, jak i STAT2 mogą odgrywać rolę w przyciąganiu USP18 do IFNAR2.
Sieć białkowo-białkowa ISG zidentyfikowana w usieciowanych komórkach traktowanych IFNα.(A) Wykres interakcji 2D przedstawiający interakcje białko-białko (wygenerowany w programie SIM-XL), z liniami reprezentującymi interakcje międzycząsteczkowe (odcięcie sieciowania ustawione na 3,5).Domeny o różnych tożsamościach są oznaczone kolorem32: domena MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) i GED (569–660).Domeny OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) i OAS1_C (903-108).Domena ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) i fn3 (777–864).Pola STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) i STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Okrągła przeglądarka usieciowanych białek (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 i STAT1) z interakcjami i interakcjami oznaczonymi odpowiednio na niebiesko i czerwono.Próg cross-linku ustalono na 3,5.Wykresy kropkowe wskazują miejsca interakcji STAT1 z MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) i OAS3 (F), jak również miejsca interakcji K lub S pomiędzy dwoma peptydami.Na rysunku próg oceny powiązań krzyżowych ustawiono na 3,0.(G) Różne miejsca interakcji między domenami STAT1 i OAS3 DI nałożone na ich struktury białkowe w PyMol (system grafiki molekularnej PyMOL, wersja 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (identyfikator pdb: 1bf533) i OAS3 (identyfikator pdb: 4s3n34).) programu.
U ludzi opisano dwie izoformy USP18: białko pełnej długości, zlokalizowane głównie w jądrze, oraz izoformę bez domeny N-końcowej, USP18-sf, która jest równomiernie rozmieszczona w cytoplazmie i jądrze 36 .Ponadto przewidywano, że koniec N będzie nieustrukturyzowany i nie wymaga aktywności izopeptydazy ani wiązania ISG1537.Większość interakcji zidentyfikowanych w naszym badaniu zlokalizowana była na końcu N białka, co sugeruje, że interakcje te obejmują USP18 pełnej długości (ryc. 4A, D), a zatem prawdopodobnie występują w jądrze.Co więcej, nasze dane wskazują również, że koniec N specjalizuje się w interakcjach białko-białko.Miejsce wiązania IFNAR2 znajduje się pomiędzy resztami 312-368 i co istotne, żadne z białek w kompleksie nie wiąże się z tym regionem (ryc. 4A) 37,38.Dane te łącznie wskazują, że domena wiążąca IFNAR2 jest wykorzystywana wyłącznie przez białko receptorowe.Ponadto stwierdzono, że tylko OAS3 i ROBO1 są powiązane z domenami powyżej N-końca i miejsca wiązania IFNAR2 (Figura 4A).
ROBO1 należy do nadrodziny immunoglobulin (Ig) transbłonowych cząsteczek sygnalizacyjnych i składa się z pięciu domen Ig i trzech domen fibronektyny (Fn) w regionie zewnątrzkomórkowym.Po tych domenach zewnątrzkomórkowych następuje region proksymalny do błony i pojedyncza helisa przezbłonowa 39. Nieustrukturyzowany region wewnątrzkomórkowy znajduje się na C-końcu i zawiera konserwatywne motywy sekwencji, które pośredniczą w wiązaniu białka efektorowego39.Region rozciągający się od aminokwasów ~1100 do 1600 jest w większości nieuporządkowany.Odkryliśmy, że MX1 oddziałuje z ROBO1 poprzez Ig, Fn i domeny wewnątrzkomórkowe, podczas gdy większość interakcji ze STAT1 zachodzi pomiędzy jego CCD, domeną łącznikową i C-końcem ROBO1 (ryc. 4A, E).Z drugiej strony interakcje z regionami łącznikowymi DI, DIII i OAS3 były rozłożone w całym białku ROBO1 (ryc. 4A).
Rodzina białek syntazy oligoadenylanowej (OAS) przyjmuje i wiąże wewnątrzkomórkowy dwuniciowy RNA (dsRNA), ulega zmianom konformacyjnym i syntetyzuje oligoadenylany (2-5 As) połączone 2′,5′40.Stwierdzono, że spośród trzech OAS, OAS3 wykazuje najwyższe powinowactwo do dsRNA i syntetyzuje najmniejszą ilość 2-5 As, która może aktywować RNazę L i tym samym ograniczyć replikację wirusa 41 .Rodzina OAS składa się z domen transferazy nukleotydowej podobnych do polimerazy beta (pol-β).Poprzednie badania wykazały, że aktywność katalityczna domeny C-końcowej (DIII) zależy od domeny wiążącej dsRNA (DI), która jest wymagana do aktywacji OAS342.Zaobserwowaliśmy, że domeny DI i DII OAS3 oddziałują z CCD i małym regionem połączenia między SH2 i STAT1 TAD (ryc. 4A, F).Nakładanie różnych miejsc sieciowania na strukturę białka ujawniło interakcję między arkuszem β i pętlą DBD STAT1 a otwartą kieszenią lub wnęką utworzoną przez reszty 60–75 w domenie DI OAS3 (ryc. 4G).Orientacja białek w kompleksie wskazywała również, że żadna z interakcji z OAS3 nie zakłócała ​​zdolności wiązania DNA jego domeny DI (ryc. S1A).Ponadto domena N-końcowa GTPazy MX1 intensywnie oddziałuje z domenami DI i DIII OAS3 (ryc. 4A).Zaobserwowaliśmy również interakcję między OAS1 i MX1 we wszystkich trzech powtórzeniach traktowanych IFNα, gdzie pojedyncza domena OAS1 (również aktywna katalitycznie) oddziaływała ze wszystkimi trzema domenami MX1 (rysunek S2A, B).
Białka MX należą do dużej rodziny GTPaz podobnych do dyneiny, które zawierają N-końcową domenę GTPazy, która wiąże i hydrolizuje GTP, domenę pośrednią, która pośredniczy w samoorganizacji, oraz C-końcowy zamek leucynowy, który działa jak GTPaza (LZ ).domena domena efektorowa25,43.MX1 wiąże się z podjednostkami polimeraz wirusowych, blokując transkrypcję genu wirusowego43.Wcześniej opisany przesiew dwuhybrydowy drożdży wykazał, że MX1 związany z PIAS1 hamuje aktywację genu za pośrednictwem STAT1 poprzez blokowanie aktywności wiązania DNA, a także ma aktywność ligazy SUMO E344,45.Tutaj pokazujemy, że MX1 wiąże się ze STAT1 (ryc. 4C, D), jednak sposób, w jaki ta interakcja wpływa na aktywację genu za pośrednictwem STAT1 w odpowiedzi na IFNα, wymaga dalszych badań.Ponadto odkryliśmy również, że MX1 wchodzi w interakcję z IFIT3 i DDX60 we wszystkich trzech powtórzeniach traktowanych IFNα (ryc. S2C).
DDX60 jest indukowaną IFN helikazą cytoplazmatyczną, o której wcześniej donoszono, że odgrywa rolę w niezależnej od RIG-I degradacji wirusowego RNA46.Oddziałuje z RIG-I i aktywuje jego sygnalizację w sposób specyficzny dla liganda 46. DDX60 składa się z domeny helikazy DEXD/H-Box i C-końcowej domeny helikazy, które wiążą wirusowe RNA i DNA47.Większość jego interakcji z MX1 i IFIT3 zachodzi w długich regionach N- i C-końcowych bez domen kanonicznych lub motywów (ryc. S2E, F).Jednakże MX1 jest również powiązany z domeną helikazy DEXD/H-Box (ryc. S2E).Białka z rodziny IFIT mają tandemowe kopie charakterystycznego motywu helisa-skręt-helisa zwanego powtórzeniem tetrapeptydowym (TPR).Stwierdzono, że IFIT3 jest pozytywnym modulatorem sygnalizacji RIG-I, a zatem składnikiem kompleksu MAVS.Podsumowując, nasze dane sugerują, że IFIT3 i DDX60 oddziałują głównie w regionie pomiędzy TPR 3–6 IFIT3 i mogą odgrywać rolę w sygnalizacji RIG-I / MAVS (ryc. S2F).
Biorąc pod uwagę, że badanie przesiewowe całego proteomu wymaga intensywnych obliczeń, następnie przeszukaliśmy całą bazę danych ludzkiego UniProt pod kątem obecności jednego z powtórzeń traktowanych IFNα.W tej replice znaleźliśmy kilka wysoce niezawodnych sieci interakcji dla HLA-A.Analiza szlaków białkowych zidentyfikowanych za pomocą widm MS/MS wykazała, że ​​przetwarzanie i prezentacja antygenu oparte na MHC-I jest głównym szlakiem indukowanym przez interferon (ryc. 3D).Dlatego skupiliśmy się na badaniu interakcji białek cząsteczek MHC-I z dużym stopniem pewności we wszystkich usieciowanych próbkach.HLA składa się z domen α1, α2 i α3 oraz łańcuchów lekkich, a mikroglobulina β2 (β2m) jest stałym białkiem opiekuńczym49.Po złożeniu w retikulum endoplazmatycznym HLA jest niestabilny w przypadku braku ligandów peptydowych50.Rowek wiążący peptyd jest utworzony przez wysoce polimorficzne i nieustrukturyzowane domeny α1 i α2 w postaci niepeptydowej oraz stosunkowo mniej polimorficzną domenę α351.W obecności IFNα wykryliśmy dwa kompleksy HLA-A: jeden oddziałuje z HMGA1 i H2B (ryc. 5, tabela S3), a drugi z MDN1, LRCH4 i H2B (ryc. 6).
IFNα indukuje sieć interakcji HLA-A z H2B (H2BFS) i HMGA1.(A) Wykres 2D (wygenerowany w programie SIM-XL) przedstawiający różne typy interakcji w kompleksie H2B-HLA-A-HMGA1: połączenie wzajemne (niebieski), połączenie wzajemne (czerwony) i pojedyncze łącze (czarny)..Domeny o różnej tożsamości są oznaczone kolorami32: H2B (histon; 2–102) i MHC-I (MHC_1; 25–203, grupa C1; 210–290 i MHC_I_C; 337–364).Próg cross-linku ustalono na 3,5.Wykresy kropkowe wskazują miejsca interakcji HLA-A z H2B (B) i HMGA1 (C), jak również miejsca interakcji K lub S pomiędzy dwoma peptydami.Na rysunku próg oceny powiązań krzyżowych ustawiono na 3,0.(D) Zależności między białkami pokazane w strukturach białek H2B, HLA-A i HMGA1 w programie PyMOL.Struktury te modelowano przy użyciu serwera Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2), a struktury matrycowe dla białek H2B, HLA-A i HMGA1 miały odpowiednio 1kx552, 1kj349 i 2eze55.
IFNα indukuje sieć interakcji HLA-A z H2B (H2BFS), MDN1 i LRCH4.(A) Wewnątrzcząsteczkowe (czerwone) i międzycząsteczkowe (niebieskie) wiązania poprzeczne przedstawione na interaktywnej mapie 2D (wygenerowanej w oprogramowaniu SIM-XL) z MDN1 przedstawionym jako okrąg.Próg cross-linku ustalono na 3,5.Domeny o różnej tożsamości są oznaczone kolorami32: H2B (histon; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grupa C1; 210–290 i MHC_I_C; 337–364) oraz LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) i CH (535–641)).(B) Zależności między białkami pokazane w strukturach białek H2B, HLA-A, LRCH4 i MDN1 w programie PyMOL.Struktury te modelowano przy użyciu serwera Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ze strukturami szablonowymi 1kx552, 1kj349, 6hlu62 i 6i2665 dla białek H2B, HLA-A, LRCH4 i MDN1, odpowiednio.Wykresy punktowe przedstawiające miejsca interakcji K lub S dla HLA-A z H2B (C), LRCH4 (D) i MDN1 (E).Dla poletek próg punktacji usieciowania ustalono na 3,0.
Oprócz utrzymania integralności genomu, histon H2B bierze także udział w regulacji transkrypcji.Białko H2B składa się z centralnej domeny histonowej (HFD) utworzonej przez trzy α-helisy oddzielone pętlami i C-końcowym ogonem 41,52.Większość interakcji z H2B zachodzi w helisie α1, która zapewnia trimeryzację z heterodimerem HFD (ryc. 5A, B).Chociaż lizyny biorą udział w wiązaniu DNA, niektóre lizyny są również alternatywnymi miejscami acetylacji lub metylacji.Na przykład reszty K43, K46 i K57 z H2B nie biorą udziału w bezpośrednim wiązaniu DNA, ale są celami różnych modyfikacji potranskrypcyjnych53.Podobnie reszty K44, K47 i K57 w H2B mogą odgrywać alternatywną rolę w obecności IFNα, w tym w interakcjach z innymi białkami (ryc. 5A, B).Ponadto pozachromosomalny histon H2B aktywuje odpowiedź immunologiczną w różnych typach komórek, działając jako czujnik cytozolowy do wykrywania fragmentów dwuniciowego DNA (dsDNA) pochodzących z czynników zakaźnych lub uszkodzonych komórek54.W obecności wirusów DNA niedobór H2B hamował wytwarzanie IFN-β i fosforylację STAT154.Wiadomo również, że H2B przemieszcza się do i z jądra szybciej niż inne histony rdzeniowe54.W wybranych nietraktowanych próbkach zaobserwowano także interakcje H2B z MDN1 i LRCH4.Stwierdziliśmy, że HLA-A oddziałuje z H2B we wszystkich trzech próbkach traktowanych IFNα i w jednej powtórzonej próbce nietraktowanej.Dane te odzwierciedlają rolę H2B w alternatywnej funkcji fizjologicznej niezależnej od regulacji transkrypcji.
HMGA1 (grupa AT-Hook 1 o wysokiej mobilności), mała nukleoproteina bogata w aminokwasy sprzyjające chorobie, została zidentyfikowana w powiązaniu z HLA-A.Ma kwasowy ogon C-końcowy i trzy różne DBD zwane hakami AT, ponieważ wiążą się z mniejszym rowkiem regionu bogatego w AT w dsDNA55,56.To wiązanie powoduje zginanie lub prostowanie DNA, umożliwiając kanonicznym czynnikom transkrypcyjnym dostęp do sekwencji konsensusowej.Uważa się, że ogon C-końcowy bierze udział w interakcjach białko-białko i rekrutacja czynników transkrypcyjnych, ponieważ mutanty z delecją na C-końcu nie są w stanie zainicjować transkrypcji57.Co więcej, domena ta zawiera kilka konserwatywnych miejsc fosforylacji, które są znanymi substratami dla kinaz 58 .Zaobserwowaliśmy interakcje HLA-A i H2B z HMGA1 poza domeną C-końcową, co sugeruje, że domena C-końcowa jest wykorzystywana głównie do wiązania czynników transkrypcyjnych (ryc. 5A, C).Białka HMGA konkurują z histonem H1 o wiązanie się z adaptorowym DNA, zwiększając w ten sposób dostępność57.Podobnie wydaje się prawdopodobne, że HMGA oddziałuje z histonem H2B wzdłuż DNA łącznika, konkurując z histonem H1.HMGB1 indukuje ekspresję HLA-A, -B i -C w komórkach dendrytycznych, prowadząc do ich aktywacji59, ale nie donoszono wcześniej o interakcji między HMG i HLA.Odkryliśmy, że HMGA1 oddziałuje z domenami α1 i α3 HLA-A, przy czym większość interakcji poza jego 3 DBD (ryc. 5A, C).W naszych rękach stwierdzono, że HLA-A jest zlokalizowany w jądrze (dane nie pokazane), a biorąc pod uwagę, że H2B i HMGA1 są również obecne w jądrze, ta interakcja prawdopodobnie zachodzi w jądrze.Specyficzne addukty mierzone pomiędzy H2B, HLA-A i HMGA1 pokazano na Figurze 5D.
Większość interakcji HLA-A z innymi białkami zachodzi w obrębie jego domen α1 i α2 oraz nieuporządkowanej domeny C-końcowej (ryc. 6).W jednym z tych przykładów odkryliśmy, że HLA-A oddziałuje z nieuporządkowanym N-końcowym ogonem LRCH4 (Rysunek 6A, D).LRCH4 reguluje aktywację TLR4 i indukcję cytokin LPS, modulując w ten sposób wrodzoną odpowiedź immunologiczną60,61.Jest to białko błonowe z dziewięcioma powtórzeniami bogatymi w leucynę (LRR) i motywem homologii kalmoduliny (CH) w swojej ektodomenie, po której następuje domena transbłonowa (TMD) 60, 62.Donoszono, że domeny CH pośredniczą w interakcjach białko-białko 60 .Odcinek około 300 aminokwasów pomiędzy domenami LRR i CH jest stosunkowo dostępny, ale nieuporządkowany.Opierając się na funkcji nieuporządkowanych regionów jako mediatorów sieci białko-białko i transportu pęcherzykowego 63, odkryliśmy, że większość interakcji białek zachodzi w nieuporządkowanych regionach.Interakcje z MDN1 były rozłożone na całej długości białka, w tym w domenach LRR1, LRR6, CH i regionach losowych, podczas gdy H2B wiązał się głównie z domeną CH (ryc. 6A, B).Warto zauważyć, że żadna z interakcji nie obejmowała TMJ, co sugeruje specyfikę podejścia CLMS (ryc. 6A, B).
MDN1 zidentyfikowano także jako część sieci białek HLA-A (Figura 6A).Należy do rodziny białek AAA (ATPazy związane z różnymi aktywnościami).Jest to ta sama N-końcowa domena AAA, która organizuje się w pierścień heksameryczny i usuwa czynnik składania z podjednostki rybosomu 60S 64.wydaje się być podobna do dyneiny64,65,66.Dodatkowo, po regionie bogatym w Asp/Glu następuje domena MIDAS (miejsce zależne od jonów metali).Ze względu na duży rozmiar MDN1 (około 5600 aminokwasów) i jego ograniczoną homologię z dobrze zbadanymi białkami, niewiele wiadomo na temat jego struktury i funkcji u ludzi.Zidentyfikowaliśmy HLA-A, H2B i LRCH4 jako partnerów wiążących MDN1 i ujawniliśmy ich orientację jako kompleksy białkowe w PyMol (ryc. 6A, B).Te trzy białka oddziałują z domeną AAA, domeną łącznika podobną do dyneiny i prawdopodobnie domeną MDN1 MIDAS.W poprzednim raporcie oczyszczanie białek przynęty za pomocą powinowactwa zidentyfikowało MDN1 jako białko związane z histonem H2B67.Ponadto w niedawnym badaniu odnotowano również interakcję między MDN i HLA-B w komórkach HCT116 przy użyciu spektrometrii masowej oczyszczonej przez powinowactwo, co potwierdza nasze ustalenia68.Identyfikacja tego kompleksu w próbkach traktowanych IFNα sugeruje rolę MDN1 w sygnalizacji interferonu.
Ponieważ geny HLA są wysoce polimorficzne, wyodrębniliśmy odczyty sekwencjonowania mapujące HLA-A, -B i -C z danych sekwencjonowania RNA komórek Flo-1 (dane nie pokazane).Sekwencje peptydowe zgodne z odczytem sekwencjonowania ujawniły znaczące różnice między HLA-A, -B i -C w regionach, w których w HLA-A znajdowały się usieciowane peptydy (Figura S3).Ponadto nie zaobserwowaliśmy sieciowania międzybiałkowego cząsteczek HLA-B/C z białkami H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Sugeruje to, że interakcja białkowa stwierdzona pomiędzy HLA-A, MDN1, LRCH1 i HMGA1 jest specyficzna dla HLA-A.Ponadto analiza proteomiczna nieusieciowanych próbek (Tabela S4) wykazała, że ​​HLA-A ma większe pokrycie sekwencji w porównaniu z HLA-B lub HLA-C.Peptydy zidentyfikowane dla HLA-A miały wysoką intensywność zarówno w próbkach traktowanych IFNα, jak i nietraktowanych.
Aby upewnić się, że zidentyfikowane tutaj interakcje nie wynikają z niespecyficznego sieciowania dwóch białek w bliskiej odległości przestrzennej, dodatkowo potwierdziliśmy dwa nowe czynniki oddziałujące z HLA-A, wykonując testy koimmunoprecypitacji.Interakcje HLA-A z endogennymi MDN1 i H2B wykryto zarówno w komórkach Flo-1 traktowanych i nietraktowanych IFNα (Figura 7, Figura S4).Potwierdziliśmy, że HLA-A był wychwytywany przez H2B w immunoprecypitatach i że to powiązanie było spowodowane traktowaniem IFNα, ponieważ HLA-A był nieobecny w próbkach immunoprecypitatu z komórek nietraktowanych (Figura 7A).Jednakże nasze dane sugerują, że IFNα w różny sposób reguluje wiązanie HLA-A z H2B i MDN1.IFNα indukuje związek między H2B i HLA-A, ale zmniejsza jego związek z MDN1.Odkryliśmy, że w grupie kontrolnej MDN1 było powiązane z HLA-A, a dodatek IFNα zmniejszał tę interakcję niezależnie od indukcji MDN1 przez IFNα (Figura 7B, C).Ponadto immunoprecypitacja HLA-A wychwyciła H2B w komórkach A549 (ryc. S4), co sugeruje, że ta interakcja jest niezależna od typu komórki.Podsumowując, wyniki te potwierdzają interferony, w których pośredniczy interferon, interakcje HLA-A z H2B i MDN1.
HLA-A współoczyszcza H2B i MDN1.Reprezentatywne endogenne immunobloty H2B (A) i MDN1 (B) poddano immunoprecypitacji z komórek Flo-1 traktowanych IFNα i sondowano pod kątem wskazanych przeciwciał.Jako kontrolę negatywną zastosowano mysie i królicze IgG.(C) Względne ilości (wejście) różnych antygenów przedstawiono za pomocą immunoblotów sondowanych przeciwko wskazanym przeciwciałom, β-aktynę zastosowano jako kontrolę ładowania.
Zbadano właściwości strukturalne jednej z wysoce niezawodnych usieciowanych sieci indukowanych interferonem, H2B-HLA-A-HMGA1.Wykorzystaliśmy modelowanie dynamiki molekularnej jako alternatywne podejście do zrozumienia dynamiki konformacyjnej białek zaangażowanych w ten kompleks (Rysunek 8).Wnioski z danych CLMS sugerują możliwość różnych konformacji białek H2B, HLA-A i HMGA1.Dlatego w środowisku rozpuszczalnikowym modelowano następujące potencjalne kompleksy: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A i H2B-HLA-A-HMGA1.Początkowy ekran dokowania białko-białko przy użyciu pakietu MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) zasugerował możliwe konformacje, które różnią się między tymi białkami (ryc. 8A).Wizualizacja kompleksu białek dokujących ujawniła kilka interakcji i możliwych konformacji (Rysunek 5A, 8).Zatem jedną z możliwych konformacji pokazano na rysunku 8A (ze znakowanymi wiązaniami poprzecznymi) i poddano ją dalszej ocenie przy użyciu potoku modelowania MD.Ponadto wiązanie H2B lub HMGA1 z HLA-A uwydatnia wyższe powinowactwo H2B do HLA-A (ryc. 8A).
Dynamika konformacyjna możliwych sieci pomiędzy kompleksami H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A i H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Lewy panel to mapa 2D (wygenerowana w oprogramowaniu SIM-XL) wewnątrzcząsteczkowych (czerwony) i międzycząsteczkowych (niebieski) wiązań poprzecznych (odcięcie usieciowania ustawione na 3,5).Ponadto zidentyfikowane reszty sieciujące są znakowane na strukturach białek H2B, HLA-A i HMGA1.Powiązane konformacje tych białek wyodrębniono za pomocą rurociągu dokującego zaimplementowanego w pakiecie MOE.Lewy dolny panel pokazuje różne możliwe konformacje kompleksów H2B-HLA-A i HMGA1-HLA-A z różnymi powinowactwami wiązania białko-białko (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Odchylenie standardowe (RMSD) pozycji atomów (z wyłączeniem atomów wodoru) dla każdej struktury białka.(C) Oddziaływania międzycząsteczkowych wiązań wodorowych białko-białko z różnych symulowanych kompleksów, biorąc pod uwagę specyficzne interakcje o czasie trwania ≥ 10 ns.Odległość odcięcia donor-akceptor wiązania h ustawiono na 3, 5 Å, a kąt odcięcia donor-H-akceptor ustawiono na ≥ 160°–180°.(D) Znakowane reszty tworzące interakcje białko-białko HLA-A z ich odpowiednimi partnerami, trwające ≥ 20 ns, wyekstrahowane z fikcyjnych kompleksów HLA-A-H2B i HLA-A-HMGA1.Struktury białkowe reprezentują średnią strukturę 100 ns MDS.(E) Interakcje między kompleksami HLA-A-H2B i HLA-A-HMGA1 w porównaniu z interakcjami śledzonymi za pomocą symulacji H2B-HLA przez 100 ns w oparciu o miejsce interakcji K lub S pomiędzy dwoma peptydami.Kompleksy /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Wartość progową oceny powiązań poprzecznych ustalono na 3,0 i uwzględniono specyficzne interakcje z MDS trwające ≥ 10 ns.Struktury białek wizualizowano przy użyciu pakietów BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, Kalifornia, USA) i pakietów Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).
Stabilność cząsteczek HLA-A w czasie (odchylenie standardowe; RMSD lub odchylenie standardowe; RMSF) wskazuje, że obecność białek H2B lub HMGA1 w kompleksach stabilizuje HLA-A (Figura 8B, Figura S5).Białko HMGA1 ściśle wiąże się z miejscem B2M HLA-A, indukując stabilność aminokwasów HLA-A w kompleksie HLA-A-HMGA1 lub H2B-HLA-A-HMGA1 (Figura 8B, Figura S5).w szczególności stwierdzono, że reszty HLA ~60-90 i ~180-210 są mniej elastyczne w obecności H2B (RYS. 8B).H2B i HMGA1 wykazywały lepsze wiązanie z HLA-A w kompleksie H2B-HLA-A-HMGA1 w porównaniu z wiązaniem HLA-A z samym H2B lub HMGA1 (Figura 8C, D; Tabela S5).Reszty biorące udział w wiązaniach wodorowych (wysokie obłożenie w modelu MD ≥ 10 ns) pokrywają się z miejscami interakcji CLMS (reszty K lub S) w kompleksie, co sugeruje, że interakcje zidentyfikowane za pomocą CLMS są bardzo wiarygodne.Niezawodność (ryc. 8E).W modelowaniu CLMS i MD stwierdzono, że reszty HLA-A o długości od około 190-210 do około 200-220 aminokwasów wiążą się odpowiednio z H2B i HMGA1 (RYS. 8E).
Interakcje białko-białko tworzą dynamiczne sieci strukturalne, które pośredniczą w komunikacji wewnątrzkomórkowej w odpowiedzi na określone bodźce.Ponieważ wiele podejść proteomicznych wykrywa zmiany w ogólnym poziomie stanu ustalonego białka, dynamika interakcji białko-białko wymaga dodatkowych narzędzi do wychwytywania powierzchni wiążących, a CLMS jest jednym z takich narzędzi.System sygnalizacji interferonu to sieć cytokin, która umożliwia komórkom reagowanie na szereg środowiskowych patogennych i wewnętrznych sygnałów patologicznych, których kulminacją jest indukcja podzbiorów białek indukowanych interferonem.Zastosowaliśmy CLMS, aby ustalić, czy można zidentyfikować nowe interakcje białko-białko w panelu białek indukowanych interferonem.Do wychwytywania kompleksów białkowych wykorzystano globalną analizę sieciowania białek w modelu komórek Flo-1 reagujących na interferon.Ekstrakcja peptydów trypsynowych z komórek nieusieciowanych i usieciowanych umożliwia zliczanie peptydów, wzbogacanie szlaku i rozkład długości peptydów z określoną intensywnością LFQ.Zidentyfikowano kanoniczne białka indukowane interferonem jako pozytywną kontrolę wewnętrzną, podczas gdy zaobserwowano nowe międzycząsteczkowe i wewnątrzcząsteczkowe usieciowane addukty kanonicznych białek indukowanych interferonem, takich jak MX1, UP18, OAS3 i STAT1.Zbadano różne cechy strukturalne i interakcje w obszarach funkcjonalnych.
Interakcję pomiędzy HLA-A, MDN1 i H2B wykryto metodą immunoblottingu w komórkach Flo-1 i A549 traktowanych i nietraktowanych IFNα.Nasze wyniki podkreślają, że HLA-A tworzy kompleksy z H2B w sposób zależny od IFNα.Nasza praca stanowi interesującą drogę do dalszych badań kolokalizacji tych dwóch kompleksów.Interesujące byłoby również rozszerzenie podejścia CLMS na panel linii komórkowych w celu identyfikacji niezależnych od typu komórki interakcji białkowych za pośrednictwem interferonu.Na koniec wykorzystaliśmy modelowanie MD jako alternatywne podejście do zrozumienia dynamiki konformacyjnej białek zaangażowanych w kompleks H2BFS-HLA-A-HMGA1, który śledził przesłuchy wewnątrzcząsteczkowe i międzycząsteczkowe.Wnioski z danych CLMS sugerują możliwość różnych konformacji białek H2BFS, HLA-A i HMGA1.Możliwe różne konformacje między tymi kompleksami białek dokujących ujawniły kilka interakcji podobnych do tych obserwowanych w zbiorze danych CLMS.Jedną z głównych zalet naszej metody jest to, że pozwala ona na łatwą identyfikację oddziałujących wysoce polimorficznych genów, takich jak HLA, zatem interesujące będzie badanie interakcji białek specyficznych dla haplotypu HLA, które w innym przypadku byłyby trudne do zbadania.Podsumowując, nasze dane pokazują, że CLMS można wykorzystać do poszerzenia naszej wiedzy o sieciach sygnalizacyjnych indukowanych interferonem i zapewnić podstawę do badania bardziej złożonych układów międzykomórkowych w mikrośrodowisku guza.
Komórki Flo-1 uzyskano z ATCC i utrzymywano w DMEM (Gibco) uzupełnionym 1% penicyliną/streptomycyną (Invitrogen), 10% płodowej surowicy bydlęcej (Gibco) i przechowywano w temperaturze 37°C i 5% CO2.Inkubacja.Komórki hodowano do 70-80% konfluencji przed potraktowaniem IFNα14 (wyprodukowanym przez Edinburgh Protein Production Facility).Wszystkie pozostałe chemikalia i odczynniki zakupiono od firmy Sigma Aldrich, chyba że zaznaczono inaczej.
Komórki Flo-1 hodowano na płytkach 6-studzienkowych, a następnego dnia komórki traktowano 10 ng/ml IFNα14 przez 24 godziny do około 80% konfluencji.Komórki przemyto trzykrotnie PBS i poddano ligacji ze świeżo przygotowanym DSS (Thermo Fisher Scientific) (rozpuszczonym w DMSO) w PBS przez 5 minut w temperaturze 37°C do końcowego stężenia 0,5 mM.Reakcję sieciowania DSS zastąpiono PBS, a pozostałości DSS wygaszono przez dodanie 20 mM Tris (pH 8,0) w PBS na 15 minut w temperaturze 37°C.Komórki zebrano przez zeskrobanie i zebrano w probówkach o niskim stopniu wiązania (Axygen).
Osad komórkowy poddano lizie za pomocą 300 µl buforu do lizy mocznika (8 M mocznik, 0,1 M Tris, pH 8,5) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu wytrząsając.Wszystkie etapy wirowania przeprowadzono przy 14 000 xg w temperaturze 8°C.Odwiruj lizat przez 10 minut i przenieś supernatant do nowej probówki.Pozostałe przezroczyste cząstki rozpuszczono w 150 µl drugiego buforu do lizy (2 M mocznik, 2% (wag./obj.) SDS (dodecylosiarczan sodu)) przez 30 minut lub dłużej, aż do uzyskania jednorodnego roztworu wodnego.Lizat wirowano przez 20 minut, a supernatant zmieszano z lizatem otrzymanym w poprzednim etapie.Stężenia białek oceniano za pomocą testu Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi procedur mikropłytkowych.Próbki szybko zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80°C.
Około 100 µg rozpuszczalnego usieciowanego białka poddano obróbce stosując zmodyfikowany protokół przygotowania próbki filtracyjnej (FASP), jak opisano w Wiśniewski i in.W skrócie, białko sieciuje się za pomocą 200 µl buforu mocznikowego (8 M mocznika w 0,1 M Tris, pH 8,5), wiruje i dzieli na pół.Wszystkie etapy wirowania przeprowadzono przy 14 000 xg w temperaturze 25°C.Pierwszą połowę usieciowanego lizatu białka przeniesiono do wirówkowego urządzenia filtrującego 10 kDa Microcon wyposażonego w membranę Ultracel-10 (Merck), a następnie wirowano na filtrze przez 25 minut.Następnie dodaj drugą połowę białka do filtra i powtórz te same czynności.Odzyskiwanie białka przeprowadzono przez dodanie 100 µl 17 mM chlorowodorku tris(2-karboksyetylo)fosfiny (TCEP) w buforze mocznikowym.Odzysk mieszano w termomikserze przy 600 obr./min przez 30 minut w temperaturze 37°C.Dodatkowo kolumnę odwirowano i zredukowane usieciowane białko alkilowano przy użyciu 100 µl 50 mM jodoacetamidu w buforze mocznikowym.Reakcję alkilowania prowadzono w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności.Obracać kolumnę, przemywać ścianki kolumny 3 razy 100 µl buforu mocznikowego, a następnie odwirować.Tę samą operację przeprowadzono 3 razy, stosując 100 µl 100 mM wodorowęglanu amonu.Przed trypsynizacją probówkę zbiorczą należy wymienić na nową.Dodać bufor do trawienia zawierający 50 mM wodorowęglan amonu i 1 µl trypsyny rozcieńczonej w buforze trypsynowym (Promega).Stosunek trypsyny do białka utrzymywano na poziomie około 1:33, a reakcje trawienia inkubowano przez noc w temperaturze 37°C w wilgotnej komorze.Usieciowany peptyd wyeluowano z filtra przez wirowanie przez 25 minut.Odzysk peptydu poprawiono przez dodanie 50 µl 0,5 M NaCl do filtra, a następnie wirowanie przez 25 minut.
Kolumny C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) zastosowano do odsolenia usieciowanych peptydów trypsynowych zgodnie z protokołem opisanym przez Bouchala i wsp.70 z niewielkimi modyfikacjami.W skrócie, kolumny wirówkowe C18 aktywowano trzema przemywaniami 0,1% kwasu mrówkowego (FA) w acetonitrylu (AcN) (Merck) i dwoma przemywaniami 0,1% FA.Kolumnę uwodniano 0,1% FA przez 15 minut.Załadować próbki do kolumn wirówkowych i przemyć 3 razy 0,1% FA.Odsolone peptydy eluowano kolejno stopniowym gradientem, stosując 50%, 80% i 100% AcN w 0,1% FA.Próbki suszono w koncentratorze SpeedVac Plus (Eppendorf) aż do całkowitego zniknięcia pozostałości cieczy.Eluowane peptydy rozpuszczono w 100 µl 0,08% kwasu trifluorooctowego w 2,5% AcN i mierzono stężenia za pomocą NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Do układu LC-MS/MS wstrzyknięto około 1 µg usieciowanego peptydu na próbkę.
Usieciowane peptydy rozdzielono w systemie UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) połączonym ze spektrometrem mas Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Usieciowane peptydy zebrano na kolumnie wychwytującej C18 o średnicy wewnętrznej 300 µm i długości 5 mm przedkolumnowej wypełnionej sorbentem C18 PepMap100 i sorbentem PepMap 5 µm (Thermo Scientific).Załaduj pompę z przepływem ustawionym na 5 µl/min 0,08% kwasem trifluorooctowym rozpuszczonym w 2,5% AcN.Usieciowane peptydy rozdzielono na kolumnie analitycznej z topioną krzemionką o średnicy wewnętrznej 75 µm i długości 150 mm, wypełnionej sorbentem PepMap 2 µm (Thermo Scientific).Fazy ​​ruchome A i B składały się odpowiednio z 0,1% FA w wodzie i 0,1% FA w acetonitrylu.Gradient zaczyna się od 2,5% B i wzrasta liniowo do 40% B w ciągu 90 minut, a następnie do 90% B w ciągu następnych 2 minut.Skład fazy ruchomej utrzymywano na poziomie 90% B przez 10 minut, a następnie zmniejszano liniowo do 2,5% B w ciągu 2 minut.Kolumnę równoważono przy 2,5% B przez 8 minut przed następnym cyklem.Usieciowane peptydy wyeluowane z kolumny analitycznej zjonizowano w źródle jonizacji przez nanoelektrorozpylanie (NSI) i wstrzyknięto do spektrometru mas Exploris 480 (Thermo Scientific).
Spektrometr mas Orbitrap Exploris 480 pracował w trybie dodatniej korelacji danych.Pełne skanowanie zostało wykonane w trybie przekroju w rozdzielczości 120 000 przy ustawieniach zakresu od m/z 350 Th do m/z 2000 Th.Znormalizowany cel AGC ustawiono na 300% przy maksymalnym czasie wejściowym 50 ms.Dla peptydów ustalono wykrywanie pików monoizotopowych.Parametr relaksacji więzów ma wartość true, jeśli znaleziono zbyt mało prekursorów.Minimalną siłę jonową prekursora ustalono na 5,0e3, a w doświadczeniach uwzględniono stany ładunku prekursora do +8.
Czas cyklu pomiędzy głównymi skanami w trybie korelacji danych ustawiono na 2,5 sekundy.Dynamiczne wykluczenie masy ustawiono na 20 sekund po pierwszej fragmentacji jonu prekursorowego.Okno izolacji prekursora ustawiono na 2 Th.Rodzaj znormalizowanej energii zderzenia ze stałym trybem energii zderzenia został wybrany w zależnym od danych skanie MS/MS.Energia zderzenia ustawiona na 30%.Rozdzielczość Orbitrapa została ustawiona na 15 000, a docelowa AGC na 100%.Niestandardowy maksymalny czas wtrysku jest ustawiony na 60 milisekund.
Przed śledzeniem sieci białko-białko w usieciowanych próbkach przetworzyliśmy surowe pliki przy użyciu pakietu MaxQuant (wersja 1.6.12.0)26,27 w celu zidentyfikowania identyfikowalnych peptydów/białek w próbkach.Ponadto podobne analizy proteomiczne przeprowadzono na nieusieciowanych próbkach Flo-1 traktowanych i nietraktowanych IFNα.Dane MS/MS przeszukano w bazie danych UniProt (www.uniprot.org) (przesłano 12 sierpnia 2020 r., zawiera 75 093 wpisów) za pomocą wbudowanej wyszukiwarki Andromeda27.Poszukiwania przeprowadzono bez wskazywania specyficzności enzymu i różnych modyfikacji dezamidacji (N, Q) i utleniania (M).Tolerancje masy prekursora ustalono na 20 ppm, a jony produktu na 0,02 Da.Początkowe i maksymalne odchylenie masy ustawiono na 10 ppm.Maksymalną masę peptydu ustalono na 4600 Da, a podobieństwo sekwencji ustalono na 7–25 aminokwasów (aa).Dalszą analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu programu Perseus (wersja 1.6.10.45).Zawartość białka obliczono poprzez normalizację intensywności widmowej białka (intensywność LFQ; oznaczenie ilościowe bez znakowania)27, a wartości intensywności przeliczono na Log2.Hierarchiczne grupowanie białek zidentyfikowanych na podstawie intensywności ich peptydów zbudowano przy użyciu pakietu pheatmap (wersja 1.0.12) w R (wersja 4.1.2).Analizę wzbogacenia szlaku przeprowadzono przy użyciu bazy danych szlaków Reactome dla białek traktowanych IFNα, które były ponad czterokrotnie aktywowane w porównaniu z próbkami nietraktowanymi.
Identyfikację chemicznych wiązań krzyżowych specyficznych dla lizyny (K) lub seryny (S) w kompleksach białkowych monitorowanych za pomocą LC-MS/MS przeprowadzono przy użyciu spektroskopowej maszyny do identyfikacji (SIM-XL) dla usieciowanych peptydów (SIM-XL)29.Po pierwsze, zbadano możliwe interakcje między genami sygnatury odporności na uszkodzenia DNA (IRDS) związanymi z interferonem, wykorzystując zestaw danych dotyczących białek IRDS opisany w Padariya i wsp.28.Badanie przesiewowe wszystkich stanów i powtórzeń całego ludzkiego UniProt wymaga intensywnych obliczeń, dlatego cała baza danych ludzkiego UniProt (www.uniprot.org) (pobrana 12 sierpnia 2020 r., zawiera 75 093 wpisów) pod kątem powtórzeń leczonych IFNα.Jeden z filtrów interakcji o wysokim poziomie zaufania.Uzyskane interakcje o wysokiej istotności zostały rozszerzone i przetestowane we wszystkich powtórzeniach i warunkach.
W SIM-XL zastosowano DSS jako środek sieciujący (XL), a przesunięcie masy XL i przesunięcie masy modyfikacji ustawiono odpowiednio na 138,06 i 156,07.Rozważane są następujące miejsca reakcji sieciowania: KK, KS i KN-TERM, bez jonów reporterowych.Zarówno ppm prekursora, jak i fragmentu ustawiono na 20, a próg Xrea ustawiono na 0,15.Trypsynę uznano za całkowicie specyficzną i wdrożono metodę fragmentacji wysokoenergetycznej pułapki C (HCD).Próg dynamicznej redukcji DB XCorr i minimalną liczbę peptydów do dynamicznej redukcji DB ustalono odpowiednio na 2,5 i 2.Inne parametry to: prawdopodobieństwo monoizotopu i granica zbieżności pików, minimum 4 reszty AA na nić i maksymalny ładunek nici oraz 3 maksima pominiętych podziałów.Powstałe połączone mapy 2D przeanalizowano w (SIM-XL), a do zbudowania map 2D wykorzystano reprezentację graficzną xQuest28.Wiązania poprzeczne białek na strukturach białkowych zapewniono w PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, wersja 2.0 Schrödinger, LLC).
Struktury modeli białek utworzono przy użyciu serwera Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 stosując zasady modelowania homologii i implementację „Ukrytej Metody Markowa”.Phyre2 generuje struktury modelowe w oparciu o dopasowanie sekwencji do znanych struktur białkowych.W przypadku białek H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 i MDN1 zastosowano struktury matrycowe 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 i 6i2665.Dodatkowo wzięto pod uwagę strukturę AlphaFold71 MX1, UBP18 i ROBO1.Strukturę białka wizualizowano przy użyciu pakietu BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, Kalifornia, USA) i pakietu Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).