ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 Rura spawana dupleksowo dla przemysłu chemicznego, składnik chemiczny, Niedobór SPECC1L prowadzi do zwiększonej stabilności połączeń łączonych i zmniejszonego zrzucania komórek grzebienia nerwowego czaszki.

Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Używasz wersji przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS.Aby uzyskać najlepszą jakość, zalecamy użycie zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer).Dodatkowo, aby zapewnić bieżące wsparcie, pokazujemy witrynę bez stylów i JavaScript.

ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 Rura spawana dupleksowo dla przemysłu chemicznego

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.jest wiodącym producentem specjalizującym się w rurach bez szwu ze stali nierdzewnej, rurach wyżarzanych jasnymi, rurach zwijanych bez szwu itp.Aby ułatwić klientom spawanie rur i rurek.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.posiada najbardziej zaawansowany sprzęt do produkcji i testowania.Możemy całkowicie zaspokoić Twoje wymagania.Zgodnie z bardzo rygorystyczną normą, produkowane przez nas rury zawsze mają prawidłową tolerancję OD i WT.Kontrola tolerancji jest ściśle zgodna z normami produkcji.Nasze produkty cieszą się zawsze uznaniem klientów.Klienci, którzy kupili nasze produkty, przynieśli większe zyski.
a) OD (średnica zewnętrzna): 3,18 mm do 101,6 mm
b) WT (grubość ścianki): 0,5 mm do 20 mm
c) Długość: zgodnie z wymaganiami klienta
d) Normy: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 itp
e) Metoda procesu: ERW, EFW itp

Suwaki pokazujące trzy artykuły na slajd.Użyj przycisków Wstecz i Dalej, aby poruszać się po slajdach, lub przycisków kontrolera slajdów na końcu, aby poruszać się po poszczególnych slajdach.
Komórki grzebienia nerwowego czaszki (CNCC) oddzielają się od embrionalnych fałdów nerwowych i migrują do łuków gardłowych, które tworzą większość struktur środkowej części twarzy.Dysfunkcja CNCC odgrywa ważną rolę w etiologii rozszczepu ustno-twarzowego, częstej wady wrodzonej.U pacjentów z atypowymi i syndromowymi rozszczepami stwierdzono heterozygotyczne mutacje SPECC1L.Tutaj przedstawiamy zwiększone barwienie składników kanonicznego złącza adhezyjnego (AJ), β-kateniny i E-kadheryny w hodowanych komórkach z nokautem SPECC1L, a mikrografy elektronowe pokazują wierzchołkowo-podstawną dyfuzję AJ.Aby zrozumieć rolę SPECC1L w morfogenezie twarzoczaszki, stworzyliśmy mysi model z niedoborem Specc1l.Homozygotyczne mutanty są śmiertelne dla embrionów i wykazują upośledzone zamykanie cewy nerwowej i laminację CNCC.Barwienie białka AJ jest zwiększone w zmutowanych fałdach nerwowych.Ta wada AJ jest zgodna z defektem rozwarstwienia CNCC, wymagającym rozpuszczenia AJ.Ponadto mutanty Specc11 zmniejszyły sygnalizację PI3K-AKT i zwiększyły apoptozę.In vitro łagodne hamowanie sygnalizacji PI3K-AKT w komórkach typu dzikiego było wystarczające do wywołania zmian AJ.Co ważne, zmiany AJ wywołane przez knockdown SPECC1L można odwrócić poprzez aktywację szlaku PI3K-AKT.Podsumowując, dane te sugerują, że SPECC1L, jako nowy regulator sygnalizacji PI3K-AKT i biologii AJ, jest wymagany do zamykania cewy nerwowej i stratyfikacji CNCC.
Komórki grzebienia nerwowego czaszki (CNCC) lokalizują się w neuroektodermie grzbietowej i odłączają się od neuronabłonka rozwijających się fałdów nerwowych w procesie obejmującym przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT)1,2,3.Wstępnie migrujące nabłonkowe CNCC zakłócają połączenia międzykomórkowe i stają się migrującymi mezenchymalnymi CNCC, które wypełniają pierwszy i drugi łuk gardłowy i tworzą większość chrząstki czaszkowo-twarzowej.Zatem geny regulujące funkcję CNCC są często zakłócane w etiologii wrodzonych anomalii twarzoczaszki, takich jak rozszczepy ustno-twarzowe, które najczęściej dotykają 1/800 urodzeń w samych Stanach Zjednoczonych.Jedna z wad wrodzonych8.
Rozwarstwienie CNCC zbiega się z zamknięciem przedniej cewy nerwowej pomiędzy 8,5 a 9,5 dniem rozwoju embrionalnego u myszy.Mutanty wielu mysich genów związanych z rozszczepem twarzowo-twarzowym również wykazują pewną formę wady cewy nerwowej, w tym Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 i Pdgfrα12.Jednakże procesy zamykania cewy nerwowej i stratyfikacji CNCC można uznać za niezależne, ponieważ zmutowana mysz Splotch (Pax3) wykazuje defekty w zamykaniu cewy nerwowej bez żadnego wpływu na stratyfikację lub migrację CNCC 13,14.Dodatkowe modele myszy z defektami w rozwarstwieniu CNCC i zamknięciu cewy nerwowej pomogą w określeniu wspólnych podstaw molekularnych tych dwóch procesów.
Izolacja CNCC z komórek neuroepitelialnych wymaga rozpuszczenia połączeń adhezyjnych (AJ), które zbudowane są z kompleksów białkowych zawierających m.in. E-kadherynę, β-kateninę, α-E-kateninę i α-aktyninę związaną z włóknami aktynowymi 2 Badania nadekspresji E-kadheryny w fałdach nerwowych wykazały zmniejszenie lub opóźnienie rozwarstwienia CNCC.I odwrotnie, supresja E-kadheryny powoduje wczesną stratyfikację15,16.Wiele czynników pośredniczących w EMT podczas stratyfikacji CNCC to czynniki transkrypcyjne (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) i białka przebudowujące macierz pozakomórkową (ECM), takie jak metaloproteinazy macierzy (MMP), jednakże CNCC są bezpośrednimi regulatorami AJ cytoszkieletu. jeszcze nieznany.Wiadomo, że szlak PI3K-AKT antagonizuje poziomy E-kadheryny, co wynika głównie z badań nad nowotworami17.Ostatnie badania wykazały, że utrata sygnalizacji PI3K-AKT opartej na PDGFα u myszy prowadzi do nieprawidłowości twarzoczaszki, w tym rozszczepu podniebienia i wad cewy nerwowej12.Jednakże związek między szlakiem PI3K-AKT a stabilnością AJ po stratyfikacji CNCC jest niejasny.
Wcześniej zidentyfikowaliśmy SPECC1L jako pierwszy zmutowany gen u dwóch osób z poważnym rozszczepem rozciągającym się od ust do oka, znanym jako rozszczep skośny (ObFC) lub rozszczep Tessier IV18.Mutacje SPECC1L zidentyfikowano w dwóch rodzinach wielopokoleniowych z autosomalnie dominującym zespołem Opitza G/BBB (OMIM #145410), w którym osoby dotknięte chorobą wykazywały hiperdystans i rozszczep wargi/podniebienia19, oraz w jednej rodzinie z zespołem nadmiernego dystansu Tibi (OMIM #145420)20 .ponad połowa przypadków zespołu Opitza G/BBB jest powiązana z chromosomem X (OMIM #300000) i jest spowodowana mutacjami w genie MID1, który koduje białko 22 szkieletu komórkowego związanego z mikrotubulami.Stawiamy hipotezę, że SPECC1L, również białko związane z mikrotubulami i cytoszkieletem aktynowym, może pośredniczyć w sygnalizacji wymaganej do przebudowy cytoszkieletu aktynowego podczas adhezji i migracji komórek 18 .Dzięki badaniom in vitro i in vivo opisujemy teraz SPECC1L jako nowy regulator stabilności AJ poprzez sygnalizację PI3K-AKT.Na poziomie komórkowym niedobór SPECC1L spowodował spadek poziomu białka pan-AKT i wzrost dyspersji wierzchołkowo-podstawnej AJ, co zostało wyeliminowane poprzez chemiczną aktywację szlaku AKT.In vivo zarodki z niedoborem Specc11 wykazują upośledzone zamknięcie cewy nerwowej i zmniejszone rozwarstwienie CNCC.Zatem SPECC1L działa w wysoce regulowanej sygnalizacji opartej na adhezji komórkowej, wymaganej do prawidłowego funkcjonowania CNCC podczas morfogenezy twarzy.
Aby scharakteryzować rolę SPECC1L na poziomie komórkowym, wykorzystaliśmy wcześniej opisaną stabilną linię komórkową kostniakomięsaka U2OS z niedoborem SPECC1L18.Te stabilne komórki U2OS z nokautem SPECC1L (kd) charakteryzowały się umiarkowanym (60–70%) spadkiem poziomów transkryptów i białek SPECC1L, wraz z defektami migracji i reorganizacji cytoszkieletu aktynowego 18. Natomiast poważne przejściowe zmniejszenie Wykazano, że SPECC1L prowadzi do defektów mitotycznych 23 .Po dalszej charakteryzacji odkryliśmy, że nasze stabilne komórki SPECC1L-kd zmieniły morfologię przy bardzo wysokim stopniu konfluencji (ryc. 1).Poszczególne komórki kontrolne i komórki kd przy niskiej konfluencji wyglądały podobnie (ryc. 1A, D).24 godziny po fuzji komórki kontrolne zachowały swój prostopadłościenny kształt (ryc. 1B, E), podczas gdy komórki SPECC1L-kd uległy wydłużeniu (ryc. 1C, F).Stopień tej zmiany kształtu komórek uchwycono za pomocą obrazowania na żywo in vivo komórek kontrolnych i komórek kd (film 1).Aby określić rolę SPECC1L w zlewających się komórkach, najpierw zbadaliśmy jego ekspresję.Odkryliśmy, że poziomy białka SPECC1L wzrosły po fuzji (Figura 1G), podczas gdy poziomy transkryptu SPECC1L nie wzrosły (Figura 1H).Ponadto, wraz ze wzrostem gęstości komórek, białko SPECC1L gromadziło się na granicach międzykomórkowych (ryc. 2A-E), a wzór nakłada się na wzór β-kateniny związanej z błoną (ryc. 2A'-E').Biorąc pod uwagę powiązanie SPECC1L z cytoszkieletem aktynowym 18,23, postawiliśmy hipotezę, że SPECC1L oddziałuje ze złączami adhezyjnymi opartymi na aktynie (AJ).
(AF) Komórki z nokautem SPECC1L (DF) wydłużają się przy dużej konfluencji (F) w porównaniu z kontrolnymi komórkami U2OS (AC).Pokazane tutaj są trzy z sześciu punktów czasowych (T1, T3, T6), które wybraliśmy dla różnych gęstości komórek.(G) Analiza Western blot pokazująca, że ​​białko SPECC1L jest stabilizowane przy wysokim stopniu konfluencji w porównaniu z niskim stopniem konfluencji w komórkach kontrolnych.Western blot SPECC1L pokazuje oczekiwany prążek 120 kDa i prążek o wyższej masie cząsteczkowej, prawdopodobnie zmodyfikowany potranslacyjnie (*).Analizę Western blot przeprowadzono w tych samych warunkach dla niskiej i wysokiej konfluencji.Obrazy przedstawiające SPECC1L przy niskiej i wysokiej konfluencji pobrano z tego samego blotu.Ten sam blot usunięto i ponownie zbadano z przeciwciałem przeciwko β-aktynie.(H) Ilościowa analiza RT-PCR nie wykazała znaczących zmian w poziomach transkryptu SPECC1L.Słupki błędów reprezentują SEM z czterech niezależnych eksperymentów.
(AE) Wybraliśmy sześć punktów czasowych (T1-T6) reprezentujących zakres gęstości komórek w celu normalizacji analizy kształtu komórek i zmian AJ w komórkach U2OS z powaleniem SPECC1L (kd).Pierwsze pięć z tych punktów czasowych obejmowało pojedyncze komórki (T1), 50–70% fuzję małych skupisk komórek (T2), fuzję bez zmiany kształtu komórek kd (T3), zmianę kształtu komórek kd (T4) i zmiany 24-godzinne.w tylnej formie komórek kd (T5).Białko SPECC1L było przeważnie rozproszone w cytoplazmie w T1 (A), ale jego akumulację obserwowano na granicach międzykomórkowych w kolejnych punktach czasowych (B – E, strzałki).(FJ) β-katenina wykazuje podobną akumulację na granicach międzykomórkowych związanych z kompleksem AJ.(A'-E') SPECC1L i β-katenina wykazują nakładające się barwienie na granicach komórek przy dużej gęstości komórek (strzałki).(F'-J') W komórkach SPECC1L-kd barwienie β-kateniny wydaje się normalne przy niskiej gęstości komórek (F'-H'), ale rozszerza się wraz ze zmianą kształtu komórki (I', J'; strzałki), co wskazuje, że AJ Uległo zmianie.Pręty = 10 µm.
Następnie próbowaliśmy określić wpływ niedoboru SPECC1L na AJ.Zastosowaliśmy kilka markerów związanych z AJ, w tym kanoniczne składniki F-aktynę, miozynę IIb, β-kateninę i E-kadherynę24,25,26,27.Zwiększenie liczby włókien stresowych aktynowych w komórkach SPECC1L-kd, jak opisano wcześniej (ryc. 3A, B) 18 .Miozyna IIb związana z włóknami aktynowymi wykazywała podobny wzrost w komórkach SPECC1L-kd in vitro (ryc. 3C, D).β-katenina związana z AJ wiąże się z kadheryną na błonie komórkowej, wykazując normalny wzór ekspresji „plastra miodu” w kontrolnych kubocytach (ryc. 3E, G).Co ciekawe, na płaskich obrazach wykonanych przy użyciu mikroskopii konfokalnej barwienie β-kateniną (ryc. 3E, F) i E-kadheryną (ryc. 3G, H) na błonie komórkowej zlewających się komórek z niedoborem SPECC1L wykazywało wyraźne wzory przedłużonego barwienia.Ta ekspansja związanego z AJ barwienia β-kateniny w komórkach kd była najbardziej wyraźna przy konfluencji, ale wydawała się poprzedzać zmiany kształtu komórek (ryc. 2F-J, F'-J').Aby określić fizyczną naturę tego rozszerzonego barwienia AJ, zbadaliśmy granice komórek na wierzchołkowo-podstawnej powierzchni komórek SPECC1L-kd U2OS za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) (Figura 3I, J).W przeciwieństwie do komórek kontrolnych (ryc. 3I), które miały oddzielne obszary gęste elektronowo wskazujące na AJ (strzałki), komórki kd (ryc. 3J) wykazywały duże, ciągłe obszary o wysokiej gęstości elektronowej wskazujące na AJ wzdłuż płaszczyzny wierzchołkowej..Ponadto na przekrojach poprzecznych zaobserwowaliśmy rozległe fałdy błony komórkowej w komórkach kd (ryc. S1A, B), co wyjaśnia rozszerzony wzór prążków barwiących β-kateninę i E-kadherynę (ryc. 3F, H).Na poparcie roli SPECC1L w AJ, β-kateninę poddano koimmunoprecypitacji ze SPECC1L w lizatach zlewających się komórek U2OS (ryc. 3K).Wraz z rozszerzonym barwieniem immunologicznym dla markerów AJ, analiza TEM była zgodna z naszą hipotezą, że niedobór SPECC1L zwiększa gęstość i wariancję wierzchołkowo-podstawną AJ.
(AH) Zwiększone barwienie F-aktyną w komórkach kd po 48 godzinach od fuzji (T6; A, B).Zmienione barwienie miozyny IIb związane z F-aktyną (C, D).Gładki wzór barwienia błony β-kateniny i E-kadheryny w komórkach kontrolnych (E, G) został wzmocniony w komórkach SPECC1L-kd (F, H).Pręty = 10 µm.(I – J) Mikrografie elektronowe obserwujące połączenie międzykomórkowe wierzchołkowo-podstawne.Komórki kontrolne wykazują wyraźne obszary o dużej gęstości elektronowej, wskazujące połączenia lepkie (I, strzałki).Natomiast całe połączenie wierzchołkowo-podstawne w komórkach SPECC1L-kd wydawało się gęste elektronowo (J, strzałki), co wskazuje na zwiększoną gęstość i rozproszenie połączeń adhezyjnych.(K) β-kateninę poddano koimmunoprecypitacji ze SPECC1L w zlewających się lizatach komórkowych U2OS.Zdjęcie zrobione z jednego miejsca, przedstawiające jedno z czterech niezależnych eksperymentów.
Aby zrozumieć rolę SPECC1L w morfogenezie twarzoczaszki, stworzyliśmy mysi model z niedoborem Specc1l przy użyciu dwóch niezależnych linii komórkowych pułapki ES, DTM096 i RRH048 (BayGenomics, Kalifornia), które reprezentują intron 1, a transkrypty Specc1l zostały wychwycone w 15 (ryc. 1) .4A, rysunek S2).Genomową lokalizację wstawki wektora wabika określono przez sekwencjonowanie całego genomu i potwierdzono metodą PCR (ryc. S2).Obydwa projekty pułapek genowych umożliwiły także fuzję w ramce reporterów Specc11-lacZ po wychwyceniu.Dlatego ekspresję lacZ określoną przez barwienie X-gal zastosowano jako wskaźnik ekspresji Specc11.Obydwa allele wykazywały podobne wzorce ekspresji lacZ, przy czym pułapka genowa DTM096 w intronie 1 wykazywała silniejszą ekspresję niż RRH048 w intronie 15 (nie pokazano).Jednakże Specc1l ulega szerokiej ekspresji, ze szczególnie silną ekspresją w fałdach nerwowych w E8.5 (ryc. 4B), w cewie nerwowej i wyrostkach twarzy w E9.5 i E10.5 (ryc. 4C, D) oraz w rozwijających się kończynach przy E10.5 i oczy (ryc. 4D).Wcześniej informowaliśmy, że ekspresja SPECC1L w pierwszym łuku gardłowym w E10.5 była obecna w nabłonku i leżącym u jego podstaw mezenchymie18, zgodnie z linią CNCC.Aby przetestować ekspresję SPECC1L w CNCC, wykonaliśmy przekroje czaszki E8.5 (ryc. 4E-J) i E9.5 (ryc. 4K-).W E8.5 SPECC1L intensywnie barwił fałdy nerwowe (ryc. 4E, H), w tym komórki barwione markerami NCC (ryc. 4G, J).W E9.5 SPECC1L (ryc. 4K, N) silnie wybarwił migrujący CNCC wybarwiony wspólnie z AP2A (ryc. 4L, M) lub SOX10 (ryc. 4O, P).
(A) Schematyczne przedstawienie mysiego genu Specc11 przedstawiające insercję wektora wabika w klonach komórek ES DTM096 (intron 1) i RRH048 (intron 15).(BD) barwienie lacZ heterozygotycznych zarodków Specc11DTM096 reprezentujących ekspresję Specc11 od E8.5 do E10.5.NE = neuroektoderma, NF = fałd nerwowy, PA1 = pierwszy łuk gardłowy.(EP) Barwienie immunologiczne SPECC1L z markerami NCC AP2A i SOX10 w fałdach nerwowych E8.5 (NF; EJ) i skrawkach czaszki E9.5 (KP).Barwienie SPECC1L było szeroko obserwowane w fałdach nerwowych E8.5 (E, H; groty strzałek), w tym w komórkach znakowanych AP2A (F, G; groty strzałek) i SOX10 (I, J; groty strzałek).W E9.5 SPECC1L silnie wybarwia migrujące CNCC (K, N; strzałki) oznaczone AP2A (L, M; strzałki) i SOX10 (O, P; strzałki).
Krzyżowanie heterozygotycznych myszy Specc1lDTM096/+ i Specc1lRRH048/+ pokazuje, że dwa allele pułapki genowej nie są komplementarne i że złożone heterozygoty i embrionalne homozygoty pod względem któregokolwiek allelu pułapki genowej są śmiertelne dla embrionów (Tabela S1).Wskaźniki Mendla wskazywały na spadek przeżywalności heterozygot po urodzeniu (oczekiwane 1,34 vs. 2,0).Zauważyliśmy niską śmiertelność okołoporodową wśród heterozygot, u niektórych występowały anomalie czaszkowo-twarzowe (ryc. S3).Jednak niska penetracja tych okołoporodowych fenotypów twarzoczaszki utrudnia badanie leżących u ich podstaw mechanizmów patofizjologicznych.Dlatego skupiliśmy się na embrionalnym śmiertelnym fenotypie homozygotycznych mutantów Specc11.
Większość złożonych heterozygotycznych lub homozygotycznych zmutowanych zarodków Specc1lDTM096/RRH048 nie rozwinęła się po E9.5–10.5 (ryc. 5A–D), a cewa nerwowa nie zamykała się do przodu (ryc. 5B, D), a czasami zamykała się z tyłu (nie pokazano) ..Ta wada zamknięcia cewy nerwowej czaszki była powiązana z większością CNCC oznaczoną DLX2 pozostałą w fałdach nerwowych w punkcie E10.5, co wskazuje na brak rozwarstwienia (ryc. 5A'-D').Aby ustalić, czy całkowity rozmiar CNCC również został zmniejszony, oznaczyliśmy linie CNCC GFP w naszych liniach pułapek genowych Wnt1-Cre i ROSAmTmG.Przesyłamy strumieniowo posortowane GFP+ NCC i GFP- (RFP+) inne niż NCC z całych zarodków.W E9.5 odsetek CNCC znakowanych GFP sortowanych przepływowo nie zmienił się znacząco między zarodkami WT i zmutowanymi (nie pokazano), co wskazuje na normalną specyfikację CNCC.Dlatego postawiliśmy hipotezę, że resztkowe barwienie Wnt1-Cre i DLX2 w odsłoniętych fałdach nerwowych (ryc. 5B ') było spowodowane wadliwym układaniem warstw CNCC, prawdopodobnie z powodu zwiększonej gęstości lub rozproszenia komórek AJ, jak widać w komórkach SPECC1L-kd.Użyliśmy markerów NCC SOX10, AP2A i DLX2, aby potwierdzić obecność CNCC w fałdzie nerwowym (ryc. 5E-R).W E8.5 zaobserwowano barwienie fałdów nerwowych dla wszystkich trzech markerów NCC w skrawkach WT (ryc. 5E, G, I) i mutanta Specc11 (ryc. 5F, H, J).W E9.5, podczas gdy markery NCC barwiły migrujące NCC w skrawkach WT (ryc. 5M, O, Q), zaobserwowano resztkowe barwienie NCC w odsłoniętych fałdach nerwowych zmutowanych zarodków Specc11 (ryc. 5N, P, R).Ponieważ SOX10 i DLX2 oznaczają migrujące CNCC, wynik ten sugeruje, że CNCC z niedoborem SPECC1L osiągają specyfikację pomigracyjną, ale nie migrują z fałdów nerwowych.
Niedobór Specc11 prowadzi do wadliwego zamknięcia cewy nerwowej, rozwarstwienia komórek grzebienia nerwowego czaszki i AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Zarodek niosący migrujące komórki grzebienia nerwowego czaszki (CNCC) znakowane Wnt1-Cre (A').Natomiast zmutowane zarodki Specc11 wykazują otwarte fałdy nerwowe (B), groty strzałek) i CNCC, które nie migrowały (B ', groty strzałek).(C, D') Obrazy jasnego pola (C, D') i barwienie immunologiczne (C', D') markera CNCC DLX2 zarodków E10.5 WT (C, C') i Specc11 (D, D').W zarodkach WT E10.5 CNCC DLX2-dodatnie kolonizują łuki skrzelowe (C', strzałki), podczas gdy u mutantów wyraźne zabarwienie utrzymuje się w otwartych fałdach nerwowych (D', strzałki) i w pierwszych łukach gardłowych (D', strzałki).) z pewnymi przebarwieniami (strzałki) wskazującymi na słabe rozwarstwienie i migrację CNCC.ER) Skrawki zarodków mutantów WT i Specc1l w stadiach E8.5 (E – L) i E9.5 (M – R) znakowano markerami NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) i DLX2 (I, J, Q, R).Przy E8,5 zaobserwowano barwienie NCC w skrawkach fałdów nerwowych typu dzikiego (NF) i zmutowanych.Wspólne barwienie SOX10 i β-kateniny w E8.5 WT (K) i mutancie (L) ujawniło zwiększone barwienie β-kateniną na granicach komórek w fałdach nerwowych.W E9.5 zaobserwowano barwienie typu dzikiego migrujących CNCC (M, O, Q), podczas gdy u mutantów niestratyfikowane CNCC barwiły otwarte fałdy nerwowe (N, P, R).(S – Z) Analiza znakowania AJ in vivo w przekrojach koronowych zarodków WT i Specc11DTM096/RRH048 z mutacją E9.5.W prawym górnym rogu pokazana jest przybliżona płaszczyzna przekroju.W skrawkach zmutowanych tkanek zaobserwowano zwiększone barwienie F-aktyny (S, T) i miozyny IIb (U, V).Podobnie do wyników in vitro na Fig. 3, w zmutowanych zarodkach zaobserwowano wzmożone barwienie błon dla β-kateniny (W, X) i E-kadheryny (Y, Z).(AA-BB) Mikrofotografia elektronowa fragmentu zarodka typu dzikiego, patrzącego poza granicę komórki wierzchołkowo-podstawnej, pokazuje wyraźny obszar o dużej gęstości elektronowej, wskazujący na połączenia adhezyjne (AA, strzałki).Natomiast w skrawkach zmutowanych zarodków Specc11 (BB, strzałki) całe połączenie wierzchołkowo-podstawne jest gęste elektronowo, co wskazuje na zwiększoną gęstość i rozproszenie połączeń adhezyjnych.
Aby przetestować naszą hipotezę, że zmniejszone nawarstwianie jest spowodowane zmienionym AJ, zbadaliśmy znakowanie AJ ​​w odsłoniętych fałdach nerwowych zmutowanych zarodków Specc11 (ryc. 5S-Z).Zaobserwowaliśmy wzrost liczby włókien aktynowych (ryc. 5S, T) i jednoczesną zwiększoną lokalizację barwienia miozyny IIB na włóknach aktynowych (ryc. 5U, V).Co ważne, zaobserwowaliśmy zwiększone barwienie β-kateniny (ryc. 5W, X) i E-kadheryny (ryc. 5Y, Z) na granicach międzykomórkowych.Zbadaliśmy także barwienie NCC β-kateniną w fałdach nerwowych zarodków E8.5 (ryc. 5K, L).Barwienie β-kateniną okazało się silniejsze w zmutowanych fałdach nerwowych Specc11 (ryc. 5L i K), co sugeruje, że rozpoczęły się zmiany w AJ.Na mikrografach elektronowych skrawków czaszki zarodków E9.5 ponownie zaobserwowaliśmy zwiększone rozproszone barwienie gęste elektronowo w zmutowanych zarodkach Specc11 w porównaniu z WT (ryc. 5AA, BB i S1E-H).Podsumowując, wyniki te potwierdzają nasze wyniki in vitro w komórkach SPECC1L-kd U2OS i sugerują, że nieprawidłowe barwienie AJ ​​poprzedza stratyfikację CNCC w naszych zmutowanych zarodkach.
Biorąc pod uwagę znany antagonistyczny związek między aktywnością AKT a stabilnością E-kadheryny, 17,28 postawiliśmy hipotezę o zaangażowaniu sygnalizacji PI3K-AKT.Ponadto zaobserwowaliśmy pęcherze podnaskórkowe w niektórych zmutowanych zarodkach, które uniknęły śmiertelności (<5%) przy E9,5-10,5 i zamiast tego osiadły na poziomie około E13,5 (ryc. S3).Pęcherzyki podnaskórkowe są cechą charakterystyczną zmniejszonej sygnalizacji PI3K-AKT opartej na PDGFRα12.Fantauzzo i in.(2014) podali, że zakłócenie aktywacji PI3K opartej na PDGFRα w zmutowanych zarodkach PdgfraPI3K/PI3K powoduje powstawanie pęcherzyków podnaskórkowych, wad cewy nerwowej i fenotypów rozszczepu podniebienia.Rzeczywiście, poziomy pan-AKT i aktywnego fosforylowanego Ser473-AKT obniżono in vivo w zmutowanych tkankach Specc11 do zatrzymania embrionalnego E9.5 (ryc. 6A-D).Spadek poziomów fosforylowanego Ser473-AKT może być całkowicie spowodowany spadkiem poziomów pan-AKT in vivo (RYS. 6E) i in vitro (RYS. 6F).Spadek in vitro zaobserwowano tylko wtedy, gdy komórki U2OS były silnie zlewane ze zmianami kształtu komórek i gęstości AJ (Figura 6D).Zatem nasze dane sugerują, że SPECC1L jest nowym pozytywnym regulatorem sygnalizacji PI3K-AKT w morfogenezie twarzoczaszki.
(A – E) Skrawki czaszki E8.5 (A, B) i E9.5 (C, D) lub lizaty E9.5 z zarodków zmutowanych Specc11 (E) wykazujące poziomy aktywnego fosforylowanego S473-AKT i pan-AKT Redukcja białka w porównaniu z kontrolnym WT.Western blot przeprowadzono na lizatach typu dzikiego i lizatach zmutowanych w tych samych warunkach.Obrazy pokazane dla SPECC1L zostały pobrane z jednego blotu.Ten sam blot usunięto i ponownie zbadano z przeciwciałami anty-pan-ACT i β-aktyną.Poziomy Pan-AKT w fałdach nerwowych E8.5 (A, B) i poziomy fosforylowanego S473-AKT w skrawkach czaszki E9.5 zostały znacząco zmniejszone.(F) Poziomy Pan-AKT były podobnie obniżone w lizatach komórek SPECC1L-kd U2OS zebranych przy dużej konfluencji.Słupki błędów reprezentują SEM z trzech niezależnych oznaczeń ilościowych Western blot.(GJ) Skrawki zarodków WT w E9.5 wybarwione odpowiednio KI67 i rozszczepioną kaspazą 3, wykazujące proliferację komórek (G, G') i małą aktywność apoptotyczną (H, H').Zmutowane zarodki Specc11 wykazują porównywalną proliferację komórek (I), ale liczba komórek ulegających apoptozie jest znacznie zwiększona (J).
Następnie zbadaliśmy markery proliferacji i apoptozy.Nie zaobserwowaliśmy żadnej różnicy w proliferacji zarodków E9.5 (ryc. 6E, G w porównaniu z I) przy wskaźniku proliferacji 82,5% dla mutantów WT i 86,5% dla mutantów Specc1l, mierzonym barwieniem KI67 (p <0,56, Fisher's dokładny test).Podobnie, nie zaobserwowaliśmy żadnej różnicy w apoptozie mierzonej przez barwienie rozszczepioną kaspazą 3 w fałdach nerwowych w E8.5 aż do zatrzymania zarodka (nie pokazano) (nie pokazano).Natomiast apoptoza była znacząco zwiększona we wszystkich zarodkach z mutacją E9.5 (ryc. 6F, H i J).Ten ogólny wzrost apoptozy jest zgodny ze zmniejszoną sygnalizacją PI3K-AKT i wczesną śmiertelnością zarodków29,30,31.
Następnie, aby potwierdzić przyczynową rolę sygnalizacji PI3K-AKT w zmianach AJ w naszych komórkach kd, chemicznie zmieniliśmy szlak w komórkach kontrolnych i komórkach kd (Rysunek 7A-F).Jako marker wykorzystaliśmy fenotyp zmiany kształtu komórki obserwowany w zlewających się komórkach SPECC1L-kd, który określiliśmy ilościowo stosując stosunek najdłuższego wymiaru (długości) do odpowiedniego wymiaru pionowego (szerokości).Oczekuje się, że stosunek 1 będzie stosunkowo okrągły lub prostopadłościenny (Rysunek 7G).Oprócz kształtu komórek potwierdziliśmy również wpływ na AJ poprzez barwienie β-kateniną (ryc. 7A'-F').Hamowanie szlaku PI3K-AKT przy użyciu wortmaniny było wystarczające do zmiany kształtu komórek w komórkach kontrolnych (Figura 7A, C) i AJ (Figura 7A').Aktywator PI3K-AKT SC-79 nie wpływał na kształt komórek (RYS. 7A, E) ani ekspansję AJ (RYS. 7A') w komórkach kontrolnych.W komórkach SPECC1L-kd dalsza supresja szlaku PI3K-AKT spowodowała zwiększoną apoptozę (ryc. 7B, D) i znaczny wzrost barwienia β-kateniny (ryc. 7B'), co jest zgodne z naszymi ciężkimi mutantami in vivo.Co ważne, aktywacja szlaku PI3K-AKT znacząco poprawiła kształt komórek (ryc. 7B, F) i fenotyp AJ (ryc. 7B).Zmiany w kształcie komórek określono ilościowo jako współczynnik okrągłości komórek (CCR) i porównano pod kątem istotności, jak opisano powyżej (RYS. 7G).Rzeczywiście, w komórkach kontrolnych (ryc. 7G, CCR = 1,56) leczenie wortmanniną było wystarczające, aby znacząco zmienić kształt komórek (ryc. 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) w stopniu podobnym do obserwowanego w SPECC1L.komórki -kd (ryc. 7G, CCR = 3,46).Traktowanie wortmanniną komórek SPECC1L-kd (ryc. 7G, CCR = 3,60, nieistotne) nie było bardziej znaczące niż nietraktowane komórki kd (ryc. 7G, CCR = 3,46, nieistotne) lub komórki kontrolne traktowane wortmaniną (ryc. 7G)., CCR = 3,46, nieistotne) dodatkowo wpływa na wydłużenie komórek (7G, CCR = 3,61, nieistotne).Co najważniejsze, aktywator SC-79 AKT przywrócił wydłużony fenotyp komórek SPECC1L-kd (ryc. 7G, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Wyniki te potwierdzają, że SPECC1L reguluje sygnalizację PI3K-AKT i sugerują, że umiarkowany spadek SPECC1L wpływa na adhezję komórek, podczas gdy silny spadek prowadzi do apoptozy (ryc. 8).
(A–F') Kontrolne (A, C, E) i komórki SPECC1L-kd (B, D, F) poddane działaniu inhibitora szlaku PI3K-AKT wortmanniny (C, D) lub aktywatora SC-79 (E, F) Leczenie Nietraktowane komórki kontrolne są prostopadłościenne (A) z normalnym barwieniem komórkowym β-cat (A'), podczas gdy komórki kd są wydłużone (B) ze zwiększonym barwieniem komórkowym β-cat (B').Po supresji szlaku PI3K-AKT komórki kontrolne wydłużały się (C) wraz z ekspansją β-cat (C'), podczas gdy komórki kd zaczęły ulegać apoptozie (D), podobnie jak nasze wysoce zmutowane zarodki i wykazywały niezwykle wzmocniony β-cat.barwienie (D').Po aktywacji szlaku PI3K-AKT komórki kontrolne pozostały prostopadłościenne (E) i wykazywały normalne barwienie β-cat (E'), podczas gdy komórki kd wykazywały znacząco poprawiony kształt komórki (F) i barwienie β-cat (F'), co wskazuje (G) Stopień zmiany kształtu komórki w (AF) określono ilościowo, stosując współczynnik okrągłości komórki (CCR) najdłuższego wymiaru (długość) i odpowiadającego mu wymiaru pionowego (szerokość) przy użyciu oprogramowania MetaMorph.Nietraktowane (NT) komórki SPECC1L-kd (CCR = 3,46) były znacząco dłuższe niż komórki kontrolne (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).Hamowanie przez brzeczkę szlaku PI3K-AKT w komórkach kontrolnych było wystarczające, aby spowodować podobne wydłużenie kształtu komórek (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Podobnie aktywacja AKT przez SC-79 w komórkach SPECC1L-kd przywróciła wydłużenie komórek do poziomów kontrolnych (CCR = 1, 74, p < 6, 2 × 10–12).Traktowanie wortmanniną komórek SPECC1L-kd spowodowało zwiększoną apoptozę, ale brak dalszego wzrostu zmiany kształtu komórek (CCR=3,60) w porównaniu z nietraktowanymi komórkami kd (CCR=3,46, ns) lub komórkami kontrolnymi traktowanymi wortmanniną (3,61) obserwowanymi w .ns = nie ma znaczenia.Pokazano pomiary +/- SEM dla 50 komórek.Różnice statystyczne obliczono za pomocą testu t-Studenta.
(A) Schematyczne przedstawienie hamowania i aktywacji szlaku PI3K-AKT skutkującego odpowiednio zmianami AJ i ratunkiem.(B) Proponowany model stabilizacji białka AKT przez SPECC1L.
Wstępne CNCC wymagają lizy AJ w celu oddzielenia komórek neuroepitelialnych przedniego fałdu nerwowego1,15,32.Zwiększone barwienie składników AJ i utrata asymetrycznego rozkładu AJ wierzchołkowo-podstawnego w komórkach z niedoborem SPECC1L zarówno in vitro, jak i in vivo, w połączeniu z fizyczną bliskością SPECC1L do β-kateniny, sugerują, że SPECC1L działa w celu prawidłowego utrzymania lokalnej stabilności AJ dla mięśnie organizacyjne.cytoszkielet aktynowy.Powiązanie SPECC1L z cytoszkieletem aktynowym i β-kateniną oraz wzrost liczby skondensowanych włókien aktynowych przy braku SPECC1L jest zgodne z obserwowanym wzrostem gęstości AJ.Inną możliwością jest to, że zwiększona liczba włókien aktynowych w komórkach z niedoborem SPECC1L prowadzi do zmiany napięcia międzykomórkowego.Ponieważ stres komórkowy wpływa na dynamikę AJ 33, zmiany napięcia mogą skutkować bardziej rozproszonym AJ 34.Zatem wszelkie zmiany wpłyną na warstwy CNCC.
Wnt1 ulega ekspresji we wczesnych fałdach nerwowych, które dają początek komórkom grzebienia nerwowego.Zatem śledzenie linii Wnt1-cre oznacza zarówno przed migracją, jak i migracją NCC35.Jednakże Wnt1 oznacza również klony grzbietowej tkanki mózgowej, również pochodzące z wczesnych fałdów nerwowych 35,36, co sprawia, że ​​prawdopodobne jest, że nasze barwienie mutantów E9.5 pod kątem markerów Wnt1 w otwartych fałdach nerwowych nie jest CNCC.Nasze pozytywne barwienie markerów NCC AP2A i SOX10 potwierdziło, że odsłonięte fałdy nerwowe zmutowanych zarodków Specc11 rzeczywiście zawierały CNCC.Ponadto, ponieważ AP2A i SOX10 są markerami wczesnych migrujących NCC, dodatnie barwienie wskazało, że te komórki są pomigracyjnymi CNCC, których nie można stratyfikować za pomocą E9.5.
Nasze dane sugerują, że regulacja molekularna AJ przez SPECC1L odbywa się za pośrednictwem sygnalizacji PI3K-AKT.Sygnalizacja AKT jest zmniejszona w komórkach i tkankach z niedoborem SPECC1L.Ustalenia Fantauzzo i in.potwierdzają bezpośrednią rolę sygnalizacji PI3K-AKT w morfogenezie twarzoczaszki.(2014) wykazali, że brak aktywacji sygnalizacji PI3K-AKT opartej na PDGFRα prowadzi do fenotypu rozszczepu podniebienia.Pokazujemy również, że hamowanie szlaku PI3K-AKT jest wystarczające do zmiany AJ i kształtu komórki w komórkach U2OS.Zgodnie z naszymi ustaleniami, Cain i in.37 wykazało, że obniżenie poziomu podjednostki PI3K α110 w komórkach śródbłonka skutkuje podobnym wzrostem okołokomórkowego barwienia β-kateniny, określanym jako wzrost „wskaźnika konektywności”.Jednakże w komórkach śródbłonka, których włókna aktynowe są już dobrze zorganizowane, supresja szlaku PI3K-AKT skutkuje luźnym kształtem komórek.Natomiast komórki SPECC1L-kd U2OS wykazywały wydłużony kształt komórek.Różnica ta może być specyficzna dla typu komórki.Podczas gdy tłumienie sygnalizacji PI3K-AKT trwale wpływa na cytoszkielet aktynowy, wpływ na kształt komórki zależy od zmian napięcia spowodowanych zmianami gęstości i organizacji centralnych włókien aktynowych.W komórkach U2OS wykorzystaliśmy jedynie zmiany kształtu komórek jako marker zmiany i odzyskiwania AJ z niedoborem SPECC1L.Podsumowując, stawiamy hipotezę, że hamowanie szlaku AKT w niedoborze SPECC1L zwiększa stabilność AJ i zmniejsza rozwarstwianie w CNCC.
Co ciekawe, poziomy pan-AKT zostały obniżone in vitro i in vivo oprócz poziomów fosforylowanych 473-AKT przy braku SPECC1L, co sugeruje regulację sygnalizacji PI3K-AKT na poziomie stabilności lub obrotu białka AKT.Geny SPECC1L i MID1, oba powiązane z zespołem Opitza/GBBB, kodują białka stabilizujące mikrotubule 18,22.Mechanizm, dzięki któremu SPECC1L i MID1 pośredniczą w stabilizacji mikrotubul, nie jest w pełni poznany.W przypadku SPECC1L ta stabilizacja obejmuje zwiększoną acetylację podzbioru mikrotubul 18 .Możliwe, że SPECC1L wykorzystuje podobny mechanizm do stabilizacji innych białek, takich jak AKT.Wykazano, że acetylacja reszt lizyny w białku AKT prowadzi do zmniejszenia lokalizacji błonowej i fosforylacji38.Ponadto do lokalizacji i aktywacji w błonie wymagana jest ubikwitynacja łańcucha K63 przy tej samej reszcie lizyny na AKT39,40.Spośród kilku czynników oddziałujących z białkami SPECC1L zidentyfikowanych w różnych wysokowydajnych dwuhybrydowych badaniach przesiewowych drożdży, cztery – CCDC841, ECM2942, APC i UBE2I43 – powiązano z obrotem lub stabilnością białek poprzez ubikwitynację lub sumoilację.SPECC1L może brać udział w potranslacyjnej modyfikacji reszt lizyny AKT, wpływając na stabilność AKT.Jednak kluczowa rola SPECC1L w lokalizacji i stabilności białka AKT pozostaje do wyjaśnienia.
Poważne defekty w ekspresji SPECC1L in vivo skutkowały zwiększonym barwieniem markera AJ i wadliwą nakładką CNCC, a także zwiększoną apoptozą i wczesną śmiertelnością zarodków.Poprzednie doniesienia wykazały, że mutanty myszy ze zwiększonym poziomem apoptozy są powiązane z wadami cewy nerwowej 44,45,46,47 i wadami twarzoczaszki48.Sugerowano, że nadmierna śmierć komórek w fałdach nerwowych lub łukach gardłowych może skutkować niewystarczającą liczbą komórek wymaganych do prawidłowego ruchu morfogenetycznego 48,49,50.Natomiast nasze linie komórkowe z niedoborem SPECC1L z umiarkowanie zmniejszoną ekspresją SPECC1L wykazywały jedynie zmiany AJ bez dowodów zwiększonej śmierci komórek.Jednakże chemiczne hamowanie szlaku PI3K-AKT w tych komórkach Kd spowodowało zwiększoną apoptozę.Zatem umiarkowany spadek ekspresji lub funkcji SPECC1L zapewnia przeżycie komórek.Jest to zgodne z obserwacją, że rzadkie zmutowane zarodki Specc11, które uniknęły aresztowania w St.E9.5 – być może ze względu na zmniejszoną skuteczność wychwytywania genów – są w stanie zamknąć swoje cewy nerwowe i zatrzymać późniejszy rozwój, często z wadami twarzoczaszki (ryc. S3).Zgodne z tym jest również rzadkie występowanie heterozygotycznych zarodków Specc1l z nieprawidłowościami w obrębie twarzoczaszki – prawdopodobnie ze względu na zwiększoną skuteczność wychwytywania genów – a także odkrycie u danio pręgowanego, u którego jeden z dwóch ortologów SPECC1L (specc1lb) powoduje późne fenotypy embrionalne, w tym utratę żuchwy i obustronne rozszczepy51.Zatem heterozygotyczne mutacje powodujące utratę funkcji SPECC1L zidentyfikowane u ludzi mogą powodować niewielkie upośledzenia funkcji SPECC1L podczas morfogenezy twarzoczaszki, wystarczające do wyjaśnienia ich szczelin ustno-twarzowych.Regulacja kontaktów międzykomórkowych oparta na SPECC1L może również odgrywać rolę w palatogenezie i fuzji łuków gardłowych.Dalsze badania funkcji SPECC1L pomogą wyjaśnić rolę tymczasowych kontaktów międzykomórkowych w CNCC podczas zamykania cewy nerwowej w ruchliwości komórek neuroepitelialnych i morfogenezie czaszkowo-twarzowej.
Kontrolę kostniakomięsaka U2OS i komórki SPECC1L-kd opisano wcześniej (Saadi i in., 2011).Przeciwciała przeciwko SPECC1L również scharakteryzowano już wcześniej (Saadi i in., 2011).Przeciwciała przeciwko β-kateninie (królik; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, Teksas) (mysz; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miozyna IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ), MO) ), E-kadheryna (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kalifornia), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), fosfo-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), rozszczepiona kaspaza 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) i β-aktyna (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) zastosowano zgodnie z opisem..Włókna aktynowe barwiono barwnikiem Acti-rodaminą falloidyną (Cytoskeleton, Denver, Kolorado).
Komórki kontrolne U2OS i komórki SPECC1L-kd hodowano w standardowym DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (Life Technologies, Carlsbad, CA).W przypadku zmian AJ 2 x 105 komórek wysiano na szkło traktowane 0,1% żelatyną świńską (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i obserwowano zmiany w kształcie komórek.Komórki zbierano w różnych wskazanych punktach czasowych: 4 godziny po zaszczepieniu (t = 1), 24 godziny po zaszczepieniu (t = 2), konfluencja bez zmiany kształtu komórek (t = 3), zmiana kształtu komórek (t = 4) , 24 godziny po zmianie kształtu komórki (t = 5) i 48 godzin po zmianie kształtu komórki (t = 6) (ryc. 1, 2, 3).Aby modulować szlak PI3K-AKT, komórki hodowano we wskazanych stężeniach z inhibitorem PI3K-AKT wortmanniną (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) lub aktywatorem SC-79 (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Pożywkę zawierającą chemikalia zmieniano codziennie.
Nagrania klatka po klatce wykonano na żywych komórkach kontrolnych i komórkach KD w normalnych warunkach hodowli, a obrazy z kontrastem fazowym zbierano co 10 minut przez 7 dni.Obrazy uzyskano przy użyciu sterowanego komputerowo mikroskopu odwróconego Leica DM IRB wyposażonego w stolik mechaniczny i obiektyw 10 × N-PLAN podłączonego do kamery QImaging Retiga-SRV.Podczas obrazowania hodowle komórkowe utrzymywano w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze z 5% CO2.
Dwie linie komórkowe ES pułapki genowej DTM096 i RRH048 z Regionalnego Centrum Zasobów Mutantów Myszy (UC Davis, Kalifornia) wykorzystano do wygenerowania linii myszy z niedoborem Specc11, oznaczonych jako Specc1lgtDTM096 i Specc1lgtRRH046.W skrócie, komórki 129/REJ ES wstrzyknięto do blastocyst C57BL6.Powstałe chimeryczne samce myszy krzyżowano z samicami myszy C57BL6 w celu identyfikacji potomstwa z zabarwieniem sierści agouti.Do identyfikacji heterozygot wykorzystano obecność wstawek wektorów pułapek genowych.Myszy trzymano na mieszanym tle 129/REJ;C57BL6.Lokalizacja miejsca insercji wektora pułapki genetycznej została potwierdzona za pomocą RT-PCR, sekwencjonowania genomu i komplementacji genetycznej (rysunek uzupełniający 1).Aby prześledzić linię CNCC podwójnie heterozygotycznych myszy Specc1lGT, skrzyżowano myszy ROSAmTmG (#007576) i Wnt1-Cre (#003829) (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), aby wytworzyć allel ROSAmTmG i Wnt1-Cre w zmutowanych zarodkach Specc11.Wszystkie eksperymenty na myszach przeprowadzono zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Centrum Medycznego Uniwersytetu w Kansas.
Zarodki utrwalono w (1% formaldehyd, 0,2% aldehyd glutarowy, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) przez 60 minut w temperaturze pokojowej.Po utrwaleniu w roztworze barwiącym X-gal (5 mM żelazocyjanek potasu, 5 mM żelazocyjanek potasu, 2 mM MgCl2, 0,01% dezoksycholan sodu, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Wywoływanie barwienia przeprowadzono w temperaturze 37°C .°C w ciągu 1-6 godzin.Zarodki utrwalono w 4% PFA i wizualizowano.
Do analizy Western blot komórki poddano lizie w pasywnym buforze do lizy (Promega, Fitchburg, WI) uzupełnionym mieszaniną inhibitorów proteazy HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lizaty przetwarzano na gotowych żelach 12% poliakryloamidowych Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, Hercules, CA) i przenoszono na membrany Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Błony blokowano w 5% mleku w PBS zawierającym 0,1% Tween.Przeciwciała inkubowano przez noc w temperaturze 4°C lub przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Do generowania sygnału użyto odczynnika Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA).W celu barwienia immunologicznego zarodki utrwalono przez noc w 4% PFA/PBS i poddano kriokonserwacji.Kriosekcje tkankowe blokowano w PBS zawierającym 1% normalnej surowicy koziej (Thermo Scientific, Waltham, MA) i 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), a następnie inkubowano w temperaturze 4°C w inkubatorze podczas noc.z przeciwciałem i przeciwciałem fluorescencyjnym wtórnym (1:1000) przez 1 godzinę w temperaturze 4°C.Wybarwione skrawki umieszczono w złotym podłożu ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) i uzyskano płaskie obrazy przy użyciu mikroskopu konfokalnego Leica TCS SPE.Każde barwienie immunologiczne przeprowadzono jako trzy niezależne doświadczenia na przekrojach co najmniej dwóch zmutowanych zarodków.Pokazano reprezentatywny eksperyment.
Komórki inkubowano w modyfikowanym buforze RIPA (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% gliceryna, 2 mM EDTA i inhibitor proteazy HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) W skrócie, lizaty wstępnie oczyszczono za pomocą kulek magnetycznych białka G (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia), a następnie inkubowano przez noc w temperaturze 4°C z anty-SPECC1L lub kulkami białka IgG białka G do ekstrakcji SPECC1L i przeprowadzono Western blot przy użyciu anty-SPECC1L. Przeciwciało -β-katenina opisane powyżej Przedstawione eksperymenty co-IP są reprezentatywne dla czterech niezależnych eksperymentów.
Utrwalone hodowane komórki lub tkanki embrionalne myszy dostarczono do centrum mikroskopii elektronowej w Centrum Medycznym Uniwersytetu w Kansas.W skrócie, próbki zatopiono w żywicy EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polimeryzowano przez noc w temperaturze 60°C i pocięto na skrawki przy 80 nm przy użyciu ultramikrotomu Leica UC7 wyposażonego w diamentowe ostrze.Skrawki wizualizowano przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego JEOL JEM-1400 wyposażonego w działo 100 kV Lab6.
Jak cytować ten artykuł: Wilson, NR i in.Niedobór SPECC1L prowadzi do zwiększonej stabilności połączeń splatanych i zmniejszonego rozwarstwiania komórek grzebienia nerwowego czaszki.nauka.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Indukcja i różnicowanie grzebienia nerwowego.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR i in.Komórki grzebienia nerwowego czaszki w ruchu: ich rola w rozwoju twarzoczaszki.Amerykański dziennik genetyki medycznej.Część A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: jej wzrost i rozwój na przestrzeni 20 lat.Pediatra.patologia.laboratorium.medycyna.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU i Noten MM Przełom w genetyce rozszczepów twarzowo-twarzowych.Trendy w medycynie molekularnej 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. i Riley, FM Molekularne mechanizmy migracji i tworzenia wzorców komórek grzebienia nerwowego czaszki podczas rozwoju twarzoczaszki.Rozwój 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH i Murray, JK Rozszczep wargi i podniebienia: zrozumienie wpływów genetycznych i środowiskowych.naturalny komentarz.Genetyka 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR i in.Nieprawidłowa morfogeneza skóry, kończyn i okolicy twarzoczaszki u myszy z niedoborem czynnika regulującego interferon-6 (Irf6).Geneta Narodowa.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. i in.Dominujące mutacje w genie GRHL3 powodują zespół van der Waorda i upośledzają rozwój perydermy jamy ustnej.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ i Juriloff, DM Aktualizacja listy mutantów myszy z defektami zamknięcia cewy nerwowej i postęp w kierunku pełnego zrozumienia genetycznego zamknięcia cewy nerwowej.Badanie wad wrodzonych.Część A, Teratologia kliniczna i molekularna 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA i Soriano, P. Sygnalizacja PDGFRalfa za pośrednictwem PI3K reguluje przeżycie i proliferację w rozwoju szkieletu poprzez szlak wewnątrzkomórkowy zależny od p53.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND i Murdoch, JN Rozczochrany: Związek zbieżnej ekspansji z zamknięciem cewy nerwowej.Trendy w neurologii.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).