310 10*1mm Składnik chemiczny zwijanych rurek ze stali nierdzewnej, N-końcowe domeny spidroiny tworzą hydrożele na bazie włókienek amyloidowych i stanowią platformę do unieruchomienia białek.

Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Używasz wersji przeglądarki z ograniczoną obsługą CSS.Aby uzyskać najlepszą jakość, zalecamy użycie zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer).Dodatkowo, aby zapewnić bieżące wsparcie, pokazujemy witrynę bez stylów i JavaScript.
Suwaki pokazujące trzy artykuły na slajd.Użyj przycisków Wstecz i Dalej, aby poruszać się po slajdach, lub przycisków kontrolera slajdów na końcu, aby poruszać się po poszczególnych slajdach.

Specyfikacja

310 Dostawcy rur zwijanych ze stali nierdzewnej 10*1mm

Skład chemiczny

Właściwości mechaniczne

Rekombinowane białka jedwabiu pajęczego (białka jedwabiu pajęczego) mają wiele potencjalnych zastosowań w opracowywaniu nowych biomateriałów, ale ich multimodalny i podatny na agregację charakter sprawia, że ​​są trudne do uzyskania i łatwe w użyciu.Tutaj podajemy, że rekombinowane miniaturowe białka spidroiny i, co ważne, sama domena N-końcowa (NT) szybko tworzą samonośne i przezroczyste hydrożele w temperaturze 37 ° C.białka fuzyjne składające się z NT i białka zielonej fluorescencji lub fosforylazy nukleozydów purynowych tworzą w pełni funkcjonalne białka fuzyjne.Hydrożele.Nasze wyniki pokazują, że rekombinowane białka NT i białka fuzyjne zapewniają wysoką wydajność ekspresji i nadają hydrożelom atrakcyjne właściwości, takie jak przezroczystość, żelowanie bez sieciowania i bezpośrednie unieruchomienie aktywnych białek przy dużej gęstości.
Pająki mają aż siedem różnych zestawów gruczołów jedwabnych, z których każdy wytwarza określony rodzaj jedwabiu.Wszystkie siedem gatunków jedwabiu składa się z białek jedwabiu pajęczego (spidroin) o długości około 6000 reszt i zawiera duży centralny region powtórzeń otoczony sferycznymi domenami N- i C-końcowymi (NT i CT)1,2.Najszerzej badany rodzaj jedwabiu, brodawka pierwotna, jest wytwarzana przez gruczoł brodawki pierwotnej.W gruczole tym pojedyncza warstwa komórek nabłonkowych syntetyzuje białka spidroiny i wydziela je do światła gruczołu, gdzie występują one w postaci rozpuszczalnej (domieszkowanie) w niezwykle wysokich stężeniach (30–50% w/v)3,4.Organizacja i konformacja głównych ampułkowych białek spidroiny w gruczole była przedmiotem dyskusji, ale większość dowodów eksperymentalnych wskazuje na obecność ogólnie helikalnej i/lub losowej helikalnej konformacji oraz struktur micelarnych lub blaszkowatych5,6,7,8,9,10.Podczas gdy powtarzalne domeny regulują właściwości mechaniczne włókien jedwabiu, tworząc nanokryształy arkusza β i struktury amorficzne11,12,13,14,15, domeny końcowe regulują włókna jedwabiu w odpowiedzi na zmieniające się warunki wzdłuż gruczołu jedwabnego16,17,18.Kontrolując tworzenie jedwabiu, 19. Domeny końcowe są konserwatywne ewolucyjnie, a ich funkcja może być wspólna dla wszystkich białek spidroiny 2,20,21.Podczas przejścia przez gruczoł pH spidroiny spada z około 7,6 do < 5,716 i wzrasta pod wpływem ścinania i rozciągania wywołanego ruchem przez stopniowo zwężający się przewód.W roztworze CT jest konstytutywnym równoległym dimerem α-helikalnym17, ale w odpowiedzi na niskie pH i siły ścinające CT rozwija się i przełącza warstwy β16, 17, prawdopodobnie wyzwalając warstwy β w powtarzalnych obszarach Convert 16. NT są monomerami pod warunki odzwierciedlające warunki w świetle gruczołu i pośredniczą w rozpuszczalności spidroiny, ale przy obniżonym pH protonowanie szeregu łańcuchów bocznych kwasu karboksylowego prowadzi do dimeryzacji NT o pKa około 6,5, stabilizując w ten sposób NT i utrwalając spidroinę w dużych ilościach wielkie ilości.sieci16,18.Zatem NT odgrywa kluczową rolę w tworzeniu włókien, zmieniając się z monomeru w powłoce w dimer we włóknie23,24,25.NT pozostaje wysoce rozpuszczalny i helikalny we wszystkich badanych do tej pory warunkach16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, co zainspirowało jego opracowanie jako znacznika zwiększającego rozpuszczalność do produkcji białek heterologicznych.
Rekombinowane białko mini jedwabiu pajęczego, składające się z jednego NT, jednego krótkiego regionu powtórzeniowego, jednego CT i znacznika His6 (His-NT2RepCT) do oczyszczania, jest tak samo rozpuszczalne w buforze wodnym jak natywne białko jedwabiu pajęczego i naśladuje natywne ważne cechy jedwabiu pająka .zasięg 25.31.His-NT2RepCT można przędzić w ciągłe włókna przy użyciu maszyny biomimetycznej, w której rozpuszczalna powłoka o pH 8 jest wytłaczana do łaźni wodnej o pH 525,32,33,34,35.Fermentacja w bioreaktorze E. coli wyrażającej His-NT2RepCT i późniejsza obróbka końcowa dała po oczyszczeniu wydajność >14 g/l.Wysoka wydajność, wysoka rozpuszczalność i odpowiednia odpowiedź His-NT2RepCT na warunki kwasowe przypisuje się NT23, 25, 34.
Tutaj opisujemy szybkie tworzenie przezroczystych hydrożeli z rekombinowanych białek spidroiny, w tym samego NT, poprzez inkubację roztworu białka w temperaturze 37 ° C.Wykorzystując fluorescencję tioflawiny T (ThT), spektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM), odkryliśmy, że NT i białka mikropająków ulegają strukturalnej transformacji w β-arkusze i włókienka amyloidopodobne kiedy tworzą się żele.Ponadto białka fuzyjne NT i białka zielonej fluorescencji (GFP) lub fosforylazy nukleozydów purynowych (PNP) tworzą hydrożele z w pełni funkcjonalnymi fragmentami fuzyjnymi.Wysokowydajna ekspresja w gospodarzach heterologicznych w połączeniu z szybkim tworzeniem hydrożeli w warunkach fizjologicznych otwiera możliwość opłacalnej produkcji hydrożeli o zaprojektowanych funkcjach.
W przeciwieństwie do większości opisywanych rekombinowanych białek spidroiny36, His-NT2RepCT jest stabilny w buforze Tris-HCl przy pH 8 i można go zatężyć do 500 mg/ml bez wytrącania25.Dlatego byliśmy zaskoczeni, gdy odkryliśmy, że białko to szybko tworzy optycznie przejrzyste, samonośne hydrożele po inkubacji w temperaturze 37°C (ryc. 1b-d).Dalsze badania wykazały, że żelowanie His-NT2RepCT zachodziło w szerokim zakresie stężeń białka (10–300 mg / ml) i że stężenie to było odwrotnie skorelowane z czasem żelowania (ryc. 1c i ryc. Uzupełniająca 1).Aby dowiedzieć się, które części His-NT2RepCT pośredniczą w tworzeniu hydrożelu, następnie zbadaliśmy każdą domenę indywidualnie i w różnych kombinacjach, stosując test inwersji kolby (ryc. 1a, b).Wszystkie badane frakcje rekombinowanej spidroiny utworzyły żele (przy stężeniu białka 300 mg/ml) w czasie krótszym niż 1 godzina, z wyjątkiem wytrąconego 2Rep (ryc. 1b).Sugeruje to, że same NT i CT, w połączeniu lub w połączeniu z powtórzeniami, mogą żelować w temperaturze 37°C i że znacznik His6 nie wpływa w znaczącym stopniu na ten proces.Biorąc pod uwagę powszechne przekonanie, że NT jest wysoce rozpuszczalnym i stabilnym białkiem oraz że poprzednie doniesienia o rekombinowanych hydrożelach spidroiny przypisywały efekty żelowania zmianom konformacyjnym w regionach powtarzalnych i/lub CT, sam NT mógłby to zrobić.Odkrycie żelowania było nieoczekiwane.Tabela uzupełniająca 1) 37, 38, 39. Co ciekawe, NT już zżelował w ciągu 10 minut w stężeniu ≥ 300 mg/ml (ryc. 1c).Eksperymenty z inwersją fiolek z różnymi stężeniami NT wykazały, że przy > 50 mg/ml roztwór NT żelował szybciej niż His-NT2RepCT przy odpowiednim stężeniu (wag./obj., Figura 1c).
Schematyczne przedstawienie różnych konstruktów spidroiny badanych w tej pracy.b Czas żelowania w temperaturze 37°C dla różnych rekombinowanych białek spidroiny (300 mg/ml) potwierdzono poprzez odwrócenie fiolki.Żel CT natychmiast, bez inkubacji (<300 mg/ml), wytrąca się 2Rep (300 mg/ml, skala 5 mm).c Czas żelowania His-NT2RepCT i NT przy wskazanych stężeniach białka w temperaturze 37°C.d Fotografie hydrożeli His-NT2RepCT i NT z nadrukowanym odpowiednio pająkiem i literą „NT” (oba 200 mg/ml, podziałka 5 mm).
Hydrożele utworzone przez różne rekombinowane białka spidroiny mają nieco inne kolory, a obserwacja gołym okiem wykazuje różny stopień przezroczystości (ryc. 1b).Żele NT są wyjątkowo przejrzyste, podczas gdy inne żele stają się nieprzezroczyste.Żele His-NT2RepCT i NT odlane do cylindrycznych probówek można było usunąć z formy w stanie nienaruszonym (ryc. 1d).
Aby sprawdzić, czy powłoki naturalnego jedwabiu pajęczego żelują w warunkach, które obecnie powodują żelowanie rekombinowanych białek spidroiny, pobrano powłoki z dużego gruczołu brodawkowego szwedzkiego pająka mostkowego (Larinioides sclopetarius).Powłoki przechowywano w 20 mM buforze Tris-HCl w stężeniu 50 mg/ml (w oparciu o zmierzoną suchą masę), ale nie zaobserwowano żelowania podczas 21-dniowej inkubacji w temperaturze 37 ° C (rysunek uzupełniający 2a).
Aby określić ilościowo te żele, można zastosować pomiary reologiczne w celu zbadania procesu żelowania i określenia ogólnych właściwości mechanicznych.W szczególności monitorowanie modułu sprężystości (elastyczności) w podwyższonych temperaturach może dostarczyć informacji na temat temperatury żelowania, a także właściwości lepkosprężystych powłoki.Eksperymenty ze wzrostem temperatury (stosując 1°C/min w temperaturze 25–45°C, w oparciu o wcześniejsze badania z użyciem roztworów naturalnego jedwabiu)40,41 wykazały, że moduły zachowawcze roztworów His-NT2RepCT i NT wzrastają wraz ze wzrostem temperatury.został zwiększony (ryc. 2 i ryc. uzupełniający 3).Warto zauważyć, że moduł NT zaczął rosnąć w niższej temperaturze w porównaniu z His-NT2RepCT, co jest zgodne z krótszym czasem żelowania obserwowanym, gdy NT bezpośrednio inkubowano z His-NT2RepCT w temperaturze 37°C (Figura 1).Po kolejnym spadku temperatury moduł zachowawczy nie powrócił do niższych wartości i pozostał powyżej modułu stratności (patrz rys. uzupełniająca 3), co wskazuje na termicznie nieodwracalne stabilne żelowanie.Po zżelowaniu końcowy moduł sprężystości wahał się od 15 do 330 kPa dla hydrożeli His-NT2RepCT w stężeniu 100–500 mg/ml, a końcowy moduł sprężystości dla hydrożeli NT (100–500 mg/ml) wahał się od 2 do 1400 kPa (ryc. , 2 i pełne dane rampy) patrz rys. uzupełniająca 3).
a Zmiana temperatury podczas pomiarów His-NT2RepCT (300 mg/ml) i b NT (300 mg/ml) z wytrząsaniem.Strzałki wskazują trend temperatury, a jaśniejsze zacienienie danych modułu pamięci przedstawia testowanie przy niższych wartościach momentu obrotowego dla przyrządu niż podane przez producenta, co jest przyczyną zwiększonego hałasu.c Akumulacja modułu końcowego His-NT2RepCT i NT po podwyższonej temperaturze (100, 300 i 500 mg/ml).Wszystkie odczyty modułu są dokonywane z częstotliwością 0,1 Hz.
Jako potencjalną metodę badania zmian konformacyjnych związanych z żelowaniem zarejestrowaliśmy widma FTIR His-NT2RepCT i NT przed i po żelowaniu w temperaturze 37 ° C (ryc. 3a, b).Zgodnie z oczekiwaniami, widma roztworów His-NT2RepCT i NT odpowiadały białkom wykazującym strukturę drugorzędową α-helisa/cewka losowa, z wyraźnym pasmem przy 1645 cm-1.W przypadku obu hydrożeli żelowanie spowodowało utworzenie dwóch ramion w środkowym paśmie I przy około 1617 cm-1 i 1695 cm-1 (ryc. 3a, b), co wskazuje na tworzenie się antyrównoległych struktur β-kartki.Zmiany te można również wyraźnie zobaczyć w odpowiednich widmach żelowania drugiej pochodnej i różnicowej (rysunek uzupełniający 4b).Dwa prążki warstwy β NT były bardziej wyraźne niż w przypadku His-NT2RepCT, co wskazuje, że całkowita zawartość pasm warstwy β w hydrożelu NT była wyższa niż w hydrożelu NT2RepCT.
a widma absorpcji FTIR His-NT2RepCT i bNT (oba 500 mg/ml) przed inkubacją (roztwór) i po (żel) inkubacją w temperaturze 37°C.c Obrazy TEM ponownie zawieszonych żeli 50 mg/ml NT2RepCT i d NT.Pasek skali 200 nm.e Średnice włókien hydrożeli His-NT2RepCT i NT.n = 100 zmierzonych włókienek, p < 0,0001.Słupki błędów pokazują odchylenie standardowe.Środek słupków błędów to średnia.Do analizy statystycznej wykorzystano test t dla niesparowanych (dwustronny).f Fluorescencja ThT różnych rekombinowanych białek spidroiny (100 mg/ml) w temperaturze 37°C bez wytrząsania.Doświadczenia z inokulacją g NT (100 mg/ml) z żelu NT o stężeniu 100 mg/ml z 0%, 5%, 10% i 20% nasion.
Analiza żelu za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) wykazała, że ​​hydrożel składa się z włókienek amyloidopodobnych (ryc. 3c, 3d).Włókna utworzone przez NT były wydłużone (o średnicy 5–12 nm) i nierozgałęzione, podczas gdy włókienka His-NT2RepCT były krótsze i miały znacznie szerszą średnicę (7–16 nm) (ryc. 3e).Wyniki te pozwoliły nam śledzić kinetykę zwłóknienia za pomocą testu tioflawiny T (ThT).W przypadku wszystkich rekombinowanych białek spidroiny sygnał fluorescencyjny wzrósł, gdy próbki inkubowano w temperaturze 37 ° C (ryc. 3f, ryc. Uzupełniająca 5a).Zgodnie z tym odkryciem, badanie mikroskopowe NT i His-NT2RepCT w warunkach żelowania ujawniło jednolity wzrost fluorescencji ThT bez zauważalnej lokalnej akumulacji agregatów ThT-dodatnich (rysunek uzupełniający 5b, c).Powstawaniu włókienek ThT-dodatnich nie towarzyszył wzrost zmętnienia NT i His-NTCT (rysunek uzupełniający 5d), co oznacza, że ​​sieć włókienek w żelu może tworzyć się bez pogarszania przejrzystości żelu.Zaszczepianie poprzez dodanie małych ilości wstępnie uformowanych włókienek może znacznie przyspieszyć tworzenie włókienek niektórych amyloidów42,43,44, ale dodanie 5%, 10% lub 20% (w/w) NT do roztworu hydrokoagulantów NT.efekt siewu (ryc. 3g).Być może wynika to z faktu, że włókienka w hydrożelu są stosunkowo utrwalone i nie można ich używać jako nasion.
Nieoczekiwane zachowanie rekombinowanych białek spidroiny w wysokich temperaturach skłoniło do dalszych badań spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) w celu zidentyfikowania zmian konformacyjnych związanych z tworzeniem żelu.Widma NMR roztworów His-NT2RepCT zarejestrowane w czasie w temperaturze 37°C wykazały, że CT było nadal częściowo złożone, podczas gdy sygnały NT i 2Rep zniknęły (ryc. 4a), co sugeruje, że to głównie NT i 2Rep częściowo kontrolują tworzenie His- Hydrożel NT2RepCT.Sygnał CT został również osłabiony do 20% jego pierwotnej intensywności, co sugeruje, że CT jest również w większości utrwalony i wbudowany w strukturę hydrożelu.W przypadku mniejszej części CT, która jest tak samo ruchliwa jak we wstępnie inkubowanej próbce i dlatego jest obserwowana za pomocą NMR w roztworze, w widmach brakuje sygnałów dla pierwszych 10 ustrukturyzowanych reszt, prawdopodobnie z powodu trudnego unieruchomienia przyłączonej części His-NT2Rep.Widma NMR stanu hydrożeli -NT2RepCT wykazały dominującą obecność α-helis i warstw β oraz, w mniejszym stopniu, konformację kłębka nieuporządkowanego (ryc. 4b).Analiza przesunięć chemicznych reszt metioniny obecnych tylko w NT wykazała, że ​​domena ta została przekształcona w strukturę β-kartki.Zależne od czasu widma NT w roztworze wykazały równomierny spadek intensywności sygnału (ryc. 4c), a NMR w fazie stałej hydrożeli NT wykazało, że większość reszt NT została przekształcona w struktury β-arkusza (ryc. 4d).Konformacji 2Rep nie można było określić oddzielnie ze względu na jego tendencję do agregacji.Jednak widma NMR w stanie stałym hydrożeli NTCT i His-NT2RepCT wyglądały bardzo podobnie (ryc. 4b; ryc. Uzupełniająca 6b), co sugeruje, że 2Rep w niewielkim stopniu przyczynił się do części strukturalnej hydrożelu His-NT2RepCT.W przypadku hydrożeli CT stwierdzono, że istnieją α-helisy, β-arkusze i losowe helikalne struktury wtórne (rysunek uzupełniający 6d).Sugeruje to, że niektóre części CT pozostają α-helisami, podczas gdy inne stają się β-arkuszami.Zatem wyniki spektroskopii NMR sugerują, że NT jest ważny dla tworzenia hydrożelu, a także przekształca się w konformację arkusza β po fuzji z 2Rep i CT.Zgodnie z tym niedawno odkryliśmy, że przestrzenne zamki amyloidowe prawdopodobnie tworzą się we wszystkich pięciu helisach domeny NT, a algorytm Waltza przewidział region amyloidogenny w helisie 1 (ryc. 4e).
Widma 2D 15N-HSQC 10 mg/ml roztworu His-NT2RepCT przed (niebieski) i 19 godzin po inkubacji (czerwony) w 37°C.Poszczególne piki krzyżowe w widmie czerwonym oraz F24, G136, poliA w widmie niebieskim oznaczono jednoliterowymi symbolami aminokwasów i numerami reszt.Wstawki pokazują zależność intensywności sygnału od czasu dla wybranych reszt z domen NT, 2Rep i CT.b Widma częstotliwości radiowej w stanie stałym (RFDR) hydrożeli His-NT2RepCT.Korelacje reszt Cα/Cβ obserwowane w widmach RFDR określono poprzez porównanie z modelowymi przesunięciami chemicznymi peptydów i wartościami uzyskanymi ze statystyk82,83 i ich struktur drugorzędowych.SSB – obrotowa wstęga boczna.c Jednowymiarowe widma roztworu 15N-HSQC 10 mg/ml NT podczas inkubacji w temperaturze 37°C przez 36 godzin.Wstawka pokazuje intensywność objętościową w funkcji czasu.d Widma RFDR w stanie stałym hydrożeli NT.Wskazano korelacje reszt Cα/Cβ i ich struktur drugorzędowych obserwowane w widmach RFDR.e Na podstawie profilu skłonności do migotania NT45.79 z bazy danych Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Energię Rosetty okna przestrzennego przesunięcia błyskawicy heksapeptydu pokazano w kcal/mol.Czerwone słupki oznaczają heksapeptydy o dużej skłonności do zwłóknienia (energia Rosetty poniżej -23 kcal/mol; poniżej linii przerywanej).Zielone słupki wskazują fragmenty o energiach Rosetty powyżej progu, a zatem prawdopodobieństwo utworzenia zamków sterycznych jest mniejsze.Z analizy wyłączono fragmenty zawierające prolinę (bez kolumn).Kwadraty wskazują obszary amyloidozy przewidywane przez algorytm Waltza81 (https://waltz.switchlab.org).Sekwencja reszt aminokwasowych NT znajduje się na górze, a rodzaje reszt występujących w strukturze drugorzędowej β (określone za pomocą spektroskopii NMR w ciele stałym) pokazano na czerwono.Pozycje pięciu α-helis NT oznaczono jako (H1-H5)28.
Przy pH <6,5 HT dimeryzuje i jest odporny na denaturację wywołaną ciepłem lub mocznikiem18.Aby wyjaśnić, jak dimeryzacja i stabilność NT wpływają na żelowanie, roztwory zawierające 100 mg/ml NT kontrolowano przy pH 8, 7 i 6 za pomocą testu odwracania fiolki.Próbki NT inkubowane przy pH 8 i 7 zżelowały po 30 minutach w temperaturze 37°C, ale żel o pH 8 pozostał przezroczysty, podczas gdy żel o pH 7 wykazywał widoczny osad (ryc. 5a).Natomiast roztwór zawierający HT o pH 6 nie tworzył żelu, a po 20 minutach w temperaturze 37°C można było zaobserwować duży osad.Sugeruje to, że same dimery i/lub ich większa stabilność w porównaniu z monomerami zapobiegają żelowaniu.Nie spodziewano się tworzenia osadu NT przy pH 7 i 6, ponieważ doniesiono, że NT jest rozpuszczalny w stężeniu 200 mg/ml27, łatwo ponownie się fałduje po denaturacji cieplnej, a także zachowuje α-helisę przy niższych wartościach pH 18. Prawdopodobnym wyjaśnieniem tych rozbieżności jest to, że wcześniej opisane eksperymenty przeprowadzono w temperaturze pokojowej lub niższej, albo przy stosunkowo niskim stężeniu białka16,18,19.
Test odwracania fiolki NT (100 mg/ml) przy pH 8, 7, 6 i 154 mM NaCl (pH 8) po inkubacji w temperaturze 37°C.b Widma NT CD zi bez, odpowiednio, 154 mM NaF i 154 mM NaCl.Molowa eliptyczność przy 222 nm jest przekształcana na proporcję naturalnych fałd.c Test inwersji NT (100 mg/ml), NT* (37°C i 60°C), NTA72R (37°C) i His-NT-L6 (37°C i 60°C).d Widma CD mutantów NT NT*, NTA72R i His-NT-L6.Molowa eliptyczność przy 222 nm jest przekształcana na proporcję naturalnych fałd.e Test inwersji NTFlSp, NTMiSp i zredukowanego NTMiSp (100 mg/ml).Skala 5 mm.f Widma CD NT, NTFlSp, NTMiSp i zredukowanego NTMiSp.Molowa eliptyczność przy 222 nm jest przekształcana na proporcję naturalnych fałd.Pełne widma NT w temperaturze 25 ° C i 95 ° C pokazano na rysunku uzupełniającym 8.
Stężenie soli fizjologicznej warunkuje oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy podjednostkami NT i dimeryzację przenoszenia NT do niższego pH18.Odkryliśmy, że obecność 154 mM NaCl i NaF rzeczywiście hamowała odpowiednio żelowanie (ryc. 5a, b; ryc. uzupełniająca 2b) i że sole te zwiększały stabilność termiczną monomerów NT (ryc. 5b, ryc. Uzupełniający 8) .Sugeruje to również, że zwiększenie stabilności, a nie dimeryzacja, zapobiega tworzeniu się żelu.
Aby dokładniej zbadać rolę dimeryzacji białka i stabilność w żelowaniu, zastosowaliśmy dwa mutanty, NT* i NTA72R, które również pozostają monomeryczne przy niskim pH 28,30.NT* to mutant z odwróceniem podwójnego ładunku, w którym pozorny dipolarny rozkład ładunku monomeru jest spłaszczony, co zapobiega dimeryzacji i drastycznie zwiększa stabilność monomeru.NTA72R jest naładowanym dipolem, ale Ala podstawiony Arg znajduje się na granicy dimeru, więc mutacje zakłócają interakcje podjednostek wymagane do dimeryzacji.Po inkubacji w temperaturze 37°C NT* nie utworzył hydrożelu, podczas gdy NTA72R utworzył nieprzezroczysty żel przez 15 minut (ryc. 5c).Ponieważ zarówno NT*, jak i NTA72R nie mogą dimeryzować, ale różnią się stabilnością monomeru (ryc. 5d), wyniki te silnie sugerują, że wysoka stabilność termodynamiczna zapobiega żelowaniu NT.Potwierdza to również fakt, że HT* tworzy żel, gdy jest niestabilny w wysokiej temperaturze (po 8 minutach w 60°C; ryc. 5c).Wcześniej wykazano, że wysoka zawartość metioniny w NT upłynnia jego naturalne fałdowanie, a sześć substytutów Met do Leu (określanych tutaj jako His-NT-L6) silnie stabilizuje monomer NT46.Opierając się na założeniu, że do tworzenia żelu NT wymagana jest elastyczność strukturalna, odkryliśmy, że stabilny mutant His-NT-L6 nie żelował w 37 ° C (ryc. 5c, d).Jednakże His-NT-L6 również utworzył żel po inkubacji w temperaturze 60°С przez 60 minut (ryc. 5c).
Wydaje się, że zdolność NT do przekształcania się w struktury arkusza β i tworzenia hydrożeli ma zastosowanie do niektórych, ale nie wszystkich domen NT spidroiny.NT z różnych rodzajów jedwabiu i gatunków pająków, Trichonephila clavipes (NTFlSp), utworzyły żele pomimo stosunkowo niskiej zawartości metioniny i wysokiej stabilności termicznej (ryc. 5e, f i tabela uzupełniająca 2).Natomiast NT z małej ampullarnej spidroiny białkowej z Araneus ventricosus (NTMiSp) o niskiej stabilności termicznej i wysokiej zawartości metioniny nie tworzył hydrożeli (tabela uzupełniająca 2 i ryc. 5e, f).To ostatnie może być związane z obecnością wewnątrzcząsteczkowych wiązań dwusiarczkowych29,47.Konsekwentnie, gdy wiązania dwusiarczkowe NTMiSp uległy redukcji, po inkubacji w temperaturze 37°C przez 10 minut utworzył on hydrożel (ryc. 5e).Podsumowując, należy zauważyć, że elastyczność strukturalna jest ważnym, ale nie jedynym kryterium tworzenia żelu z NT.Innym czynnikiem, który może mieć znaczenie, jest skłonność do tworzenia włókienek amyloidowych, a analiza z wykorzystaniem bazy danych zamków błyskawicznych i algorytmu Waltza wykazała korelację między zdolnością do tworzenia żeli a obecnością regionów amyloidogennych, a także rozmiarem przewidywanych regionów do tworzenia zamków sterycznych.Wystąpiła korelacja (tabela uzupełniająca 2 i ryc. uzupełniająca 9).
Zdolność NT do tworzenia włókienek i żeli w sprzyjających warunkach doprowadziła nas do postawienia hipotezy, że fuzje NT z innymi fragmentami białek mogą nadal tworzyć żele z pełną funkcjonalnością partnerów fuzyjnych.Aby to przetestować, wprowadziliśmy odpowiednio białko zielonej fluorescencji (GFP) i fosforylazę nukleozydów purynowych (PNP) na C-końcu NT.Powstałe białka fuzyjne poddano ekspresji w E. coli z bardzo wysoką wydajnością końcową (hodowle w kolbach do wytrząsania 150 mg/l i 256 mg/l, odpowiednio, dla His-NT-GFP i His-NT-PNP), zgodnie z tym, co wykazano dla innych białek połączonych z NT Nr ref.30. Białka fuzyjne His-NT-GFP (300 mg/ml) i His-NT-PNP (100 mg/ml) utworzyły żele po 2 godzinach i 6,5 godzinach w temperaturze 37°C i, co ważne, frakcja GFP pozostała niezmieniona.obserwowane po żelowaniu, przy czym >70% początkowej intensywności fluorescencji pozostaje po żelowaniu (ryc. 6a).Aby zmierzyć aktywność PNP w roztworach i żelach his-NT-PNP, musieliśmy rozcieńczyć białko fuzyjne NT, ponieważ aktywność enzymatyczna czystego preparatu wykraczała poza zakres wykrywalności testu przy stężeniach żelujących.Żel utworzony z mieszaniny zawierającej 0,01 mg/ml His-NT-PNP i 100 mg/ml NT zachował 65% początkowej aktywności enzymatycznej wstępnie inkubowanych próbek (ryc. 6b).Żel pozostał nienaruszony podczas pomiaru (rysunek uzupełniający 10).
a Względna intensywność fluorescencji przed i po żelowaniu His-NT-GFP (300 mg/ml) i odwróconej fiolki zawierającej hydrożel His-NT-GFP (300 mg/ml) w świetle widzialnym i UV.Punkty pokazują poszczególne pomiary (n = 3), słupki błędów pokazują odchylenie standardowe.Wartość średnia jest pokazana pośrodku słupków błędów.b Aktywność PNP uzyskano metodą analizy fluorometrycznej, stosując roztwory i żele składające się z NT (100 mg/ml) i mieszaniny zawierającej 0,01 mg/ml his-NT-PNP i 100 mg/ml Nowego dolara tajwańskiego.Wstawka przedstawia odwróconą fiolkę zawierającą hydrożel zawierający His-NT-PNP (pasek skali 5 mm).
Tutaj opisujemy tworzenie hydrożeli z NT i innych rekombinowanych białek spidroiny poprzez inkubację roztworu białka w temperaturze 37°C (Rysunek 1).Pokazujemy, że żelowanie wiąże się z transformacją α-helis w β-warstwy i tworzeniem włókienek amyloidopodobnych (ryc. 3 i 4).Odkrycie to jest zaskakujące, ponieważ nanocząsteczki są zwiniętymi kulistymi wiązkami pięciu helis, znanymi z wyjątkowo wysokiej rozpuszczalności i wysokiej stabilności w stężeniach >200 mg/ml w temperaturze 4°C przez kilka dni27.Ponadto NT łatwo zwijają się ponownie po denaturacji cieplnej przy niskich stężeniach białka w µM.Zgodnie z naszymi wynikami tworzenie włókienek wymaga połączenia stężenia białka > 10 mg/ml i lekko podwyższonej temperatury (ryc. 1).Jest to zgodne z koncepcją, że włókienka amyloidowe mogą tworzyć się z białek zwiniętych w kulistości, które są w stanie częściowo rozłożonym z powodu wahań termicznych w warunkach fizjologicznych 48 .Przykłady białek ulegających tej konwersji obejmują insulinę49,50, β2-mikroglobulinę, transtyretynę i lizozym51,52,53.Chociaż NT jest α-helisą w swoim stanie natywnym, około 65% łańcucha polipeptydowego jest kompatybilne z tworzeniem zamka sterycznego (ryc. 4e) 45 .Ponieważ monomer jest dynamicznie mobilny46, może odsłonić te potencjalne regiony amyloidogenne w umiarkowanie podwyższonych temperaturach, a przy wysokich stężeniach białka całkowitego może osiągnąć stężenie krytyczne dla tworzenia włókienek amyloidowych54.Kierując się tym rozumowaniem, odkryliśmy ujemną korelację między stężeniem spidroiny a czasem żelowania (ryc. 1c), a jeśli monomeryczna konformacja NT zostanie ustabilizowana albo przez mutacje (NT*, His-NT-L6), albo przez dodatek soli, może zapobiec tworzenie hydrożeli (ryc. 5).
W większości przypadków włókienka amyloidowe znikają z roztworu w postaci osadu, ale w pewnych warunkach mogą tworzyć hydrożele55,56,57.Włókna tworzące hydrożel zazwyczaj mają wysoki współczynnik kształtu i tworzą stabilne trójwymiarowe sieci poprzez splątanie molekularne,55,58 co jest zgodne z naszymi wynikami.Do tworzenia hydrożeli in vitro białka często ulegają całkowitemu lub częściowemu rozwinięciu, na przykład pod wpływem rozpuszczalników organicznych, wysokiej temperatury (70–90°C) i/lub niskiego pH (1,5–3,0)59,60,61,62.Opisane tutaj hydrożele spidroinowe nie wymagają ostrej obróbki ani środków sieciujących w celu stabilizacji hydrożeli.
Wcześniej donoszono, że powtórzenia spidroiny i QD, które wydają się ulegać przełączaniu arkusza β podczas przędzenia jedwabiu, tworzą hydrożele.W porównaniu z naszymi ustaleniami czasy inkubacji i/lub temperatury inkubacji były odpowiednio znacznie dłuższe lub wyższe, a powstałe hydrożele były często nieprzezroczyste (ryc. 7 i tabela dodatkowa 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Oprócz krótkiego czasu żelowania, hydrożele NT >300 mg/ml (30%) przewyższały wszystkie inne opisane rekombinowane hydrożele białkowe jedwabiu pajęczego, a także naturalne hydrożele, takie jak żelatyna, alginian (2%), agar (0,5% ) i kolagen.(0,6%) (ryc. 7 i tabele uzupełniające 1 i 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Czas żelowania i moduł sprężystości hydrożeli w tym badaniu porównano z innymi hydrożelami na bazie spidroiny i wybranymi hydrożelami naturalnymi.Podano odniesienia wraz z opisem warunków żelowania.APS Nadsiarczan amonu, temperatura pokojowa.Dane 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Wydaje się, że pająki opracowały sposoby zapobiegania żelowaniu spidroiny podczas przechowywania.Pomimo wysokiego stężenia białka w gruczole jedwabnym, duży region powtórzeń związany z domeną końcową oznacza, że ​​pozorne stężenie NT i CT w gruczole odpowiada około 10-20 mg/ml na granicy tego badania.wymagane do obserwowanego in vitro tworzenia hydrożelu.Ponadto podobne stężenia soli 16 stabilizowały NT, jak w gruczołach jedwabnych (ryc. 5b).Konformację NT badano w cytozolu E. coli i stwierdzono, że jest ona bardziej zwinięta niż podczas badania in vitro, co dodatkowo wskazuje, że sól lub inne czynniki zapobiegają jej agregacji in vivo.Jednakże zdolność NT do przekształcania się w włókienka β-kartki może być ważna dla tworzenia włókien i powinna zostać zbadana w przyszłych badaniach.
Oprócz nowych aspektów tworzenia fibryli i hydrożeli podobnych do NT-amyloidu zaobserwowanych w tym badaniu, pokazujemy również, że zjawisko to może mieć zastosowania biotechnologiczne i biomedyczne (ryc. 8).Jako dowód koncepcji połączyliśmy NT z GFP lub PNP i pokazaliśmy, że białko fuzyjne tworzy również hydrożele po inkubacji w temperaturze 37 ° C i że frakcje GFP i PNP w dużej mierze zachowują swoją aktywność po żelowaniu (Rysunek 6).Fosforylazy nukleozydowe są ważnymi katalizatorami syntezy analogów nukleozydów75, co czyni nasze odkrycie istotnym dla przemysłu biofarmaceutycznego.Koncepcja ekspresji białek fuzyjnych, które w sprzyjających warunkach tworzą przezroczyste hydrożele, umożliwia tworzenie funkcjonalizowanych hydrożeli o korzystnych właściwościach do szerokiego zakresu zastosowań, takich jak immobilizacja enzymów, kontrolowane uwalnianie leków i inżynieria tkankowa.Ponadto NT i NT* są skutecznymi markerami ekspresji30, co oznacza, że ​​NT i jego warianty można wykorzystać do wysokowydajnej produkcji rozpuszczalnych białek fuzyjnych, a następnie tworzenia unieruchomionych białek docelowych w hydrożelach 3D.
NT jest rozpuszczalny, α-helikalny i stabilny w niskich stężeniach (µM) i 37°C.W tej samej temperaturze, ale przy rosnących stężeniach (>10 mg/ml), NT tworzy żele składające się z włókienek amyloidopodobnych.Białka fuzyjne NT tworzą również żele włókniste z w pełni funkcjonalnymi fragmentami fuzyjnymi, umożliwiając immobilizację różnych białek w hydrożelach 3D przy użyciu NT.U dołu: NT (PDB: 4FBS) oraz ilustracje sieci światłowodowych i powiązanych struktur białkowych (założone i nie narysowane w skali, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Konstrukty (patrz tabela uzupełniająca 4, aby zapoznać się z pełną listą obejmującą sekwencje aminokwasów) sklonowano do plazmidu pT7 i transformowano do E. coli BL21 (DE3).E. coli zawierającą zmodyfikowane plazmidy zaszczepiono w bulionie Luria uzupełnionym kanamycyną (70 mg/l) i hodowano przez noc w temperaturze 30°C i 250 obr./min.Następnie hodowlę zaszczepiono w stosunku 1/100 do pożywki LB zawierającej kanamycynę i hodowano w temperaturze 30°C i 110 obr./min, aż OD600 osiągnęło 0,8.Do badań NMR bakterie hodowano w pożywce minimalnej M9 zawierającej 2 g D-glukozy 13C (Aldrich) i 1 g chlorku amonu 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) w celu znakowania białek izotopami.Obniż temperaturę do 20 stopni Celsjusza i wywołaj ekspresję białka za pomocą 0,15 mM izopropylotiogalaktopiranozydu (stężenie końcowe).Po całonocnej ekspresji białka komórki zebrano przy 7278 x g, 4°C przez 20 minut.Osad komórek ponownie zawieszono w 20 mM Tris-HCl, pH 8 i zamrożono do dalszego użycia.Rozmrożone komórki poddano lizie przy użyciu urządzenia do rozrywania komórek (maszyny serii TS, Constant Systems Limited, Anglia) pod ciśnieniem 30 kPa.Następnie lizaty wirowano przy 25 000 g przez 30 minut w temperaturze 4°C.W przypadku NTMiSp osad ponownie zawieszono w 2 M moczniku, 20 mM Tris-HCl, pH 8 i poddano sonikacji przez 2 minuty (2 s wł./wył., 65%), następnie ponownie odwirowano przy 25 000 xg, 4°C w ciągu 30 minut.Supernatant naniesiono na kolumnę Ni-NTA, przemyto 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazolem, pH 8 i na koniec białko eluowano 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazolem, pH 8. Aby wygenerować NT2RepCT i NTCT, trawienie trombiną wprowadza miejsce (ThrCleav) pomiędzy His i NT.Miejsca rozszczepienia trombiny są również obecne w His-NT-ThrCleav-2Rep (produkuje 2Rep), His-tioredoksyna-ThrCleav-NT (produkuje NT), His-tioredoksyna-ThrCleav-CT (produkuje CT), His-Tioredoksyna-ThrCleav-NT .* (produkuje NT*), His-Tioredoxin-ThrCleav-NTA72R (produkuje NTA72R), His-Tioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (produkuje NTF1Sp) i His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (produkuje NTMiSp).Konstrukty trawiono trombiną (1:1000) i dializowano przez noc w temperaturze 4°C z 20 mM Tris-HCl, pH 8, stosując membranę dializacyjną Spectra/Por o progu masy cząsteczkowej 6-8 kDa.Po dializie roztwór ładuje się na kolumnę Ni-NTA i zbiera odciek zawierający żądane białko.Stężenia białek określono mierząc absorbancję UV przy 280 nm, stosując współczynnik ekstynkcji każdego białka, z wyjątkiem NTF1Sp, w którym zastosowano test Bradforda zgodnie z protokołem producenta.Czystość oznaczono za pomocą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym SDS (4–20%) i barwienia błękitem brylantowym Coomassie.Białka zatężono przy użyciu filtrów wirówkowych (VivaSpin 20, GE Healthcare) przy 4000 xg z wartością odcięcia masy cząsteczkowej 10 kDa w cyklach 20-minutowych.
Rozmroź roztwór białka i ostrożnie przepipetuj 150 µl do 1 ml przezroczystej fiolki z przegrodą (8 x 40 mm Thermo Scientific).Probówki zamknięto i uszczelniono parafilmem, aby zapobiec parowaniu.Próbki (n = 3) inkubowano w temperaturze 37°C lub 60°C i okresowo odwracano w celu obserwacji żelowania.Próbki, które nie uległy żelowaniu, inkubowano przez co najmniej jeden tydzień.Zredukuj wiązania dwusiarczkowe NTMiSp za pomocą 10 mM DTT na 10 µM białka.Aby przeanalizować żelowanie powłok z naturalnego jedwabiu pajęczego, wycięto pająka szwedzkiego, dwa główne ampulowane gruczoły umieszczono w 200 µl 20 mM buforu Tris-HCl o pH 8 i pocięto, aby umożliwić oddzielenie powłoki od gruczołów..Zawartość gruczołów rozpuszcza się w buforze, 50 µl do określenia suchej masy (poprzez inkubację otwartych fiolek w temperaturze 60°C do stałej masy) i 150 µl do żelowania w temperaturze 37°C.
Geometria/narzędzie pomiarowe wykonane jest ze stali nierdzewnej przy użyciu równoległej płytki o górnej średnicy 20 mm i szczelinie 0,5 mm.Ogrzewać próbkę od 25°C do 45°C i ponownie do 25°C z szybkością 1°C na minutę, stosując dolną płytkę Peltiera ze stali nierdzewnej.Pomiary drgań przeprowadzono przy częstotliwości 0,1 Hz oraz w liniowym obszarze lepkosprężystym materiału przy odkształceniu 5% i 0,5% odpowiednio dla próbek 100 mg/ml i 300–500 mg/ml.Użyj niestandardowej komory wilgotnościowej, aby zapobiec parowaniu.Dane analizowano za pomocą Prism 9.
Do zbierania widm w podczerwieni (IR) w temperaturze pokojowej od 800 do 3900 cm–1.Urządzenie ATR oraz ścieżkę światła przez spektrometr przepłukuje się suchym, przefiltrowanym powietrzem przed i w trakcie eksperymentu.Roztwory (500 mg/ml w celu zminimalizowania pików absorpcji wody w widmach) odpipetowano na kryształy i przed pomiarem utworzono żele (500 mg/ml), które następnie przeniesiono do kryształów (n = 3).Zarejestrowano 1000 skanów z rozdzielczością 2 cm-1 i zerowym współczynnikiem wypełnienia 2. Drugą pochodną obliczono za pomocą OPUS (Bruker) stosując zakres wygładzania wynoszący dziewięć punktów.Widma znormalizowano do tego samego obszaru integracji pomiędzy 1720 a 1580 cm-1 przy użyciu F. Mengesa „Spectragryph – Optical Spectrscopic Software”.W spektroskopii ATR-IR głębokość penetracji wiązki podczerwieni do próbki zależy od liczby falowej, co skutkuje silniejszą absorpcją przy niższych liczbach falowych niż przy wyższych liczbach falowych.Efekty te nie zostały skorygowane dla widm pokazanych na ryc.3, ponieważ są bardzo małe (rysunek uzupełniający 4).Skorygowane widma dla tej figury obliczono przy użyciu oprogramowania Bruker OPUS.
W zasadzie wszechstronna ocena ilościowa konformacji białek jest możliwa po wiarygodnym rozłożeniu składników w obrębie piku amidu I.W praktyce pojawiają się jednak pewne przeszkody.Szum w widmie może pojawić się jako (fałszywe) piki podczas dekonwolucji.Ponadto pik powstały w wyniku zagięcia wody pokrywa się z położeniem piku amidu I i może mieć podobną wielkość w przypadku próbek zawierających dużą ilość wody, takich jak badany tutaj wodny żel.Dlatego nie próbowaliśmy całkowicie rozłożyć piku amidu I, a nasze obserwacje należy rozpatrywać jedynie na poparcie innych metod, takich jak spektroskopia NMR.
Roztwory 50 mg/ml NT i His-NT2RepCT żelowano przez noc w temperaturze 37°C.Hydrożel następnie rozcieńczono 20 mM Tris-HCl (pH 8) do stężenia 12,5 mg/ml, dobrze wytrząsano i pipetowano w celu rozbicia żelu.Następnie hydrożel rozcieńczono 10-krotnie 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 µl próbki naniesiono na miedzianą siatkę pokrytą formvarem, a nadmiar próbki usunięto bibułą.Próbki przemywano dwukrotnie 5 µl wody MilliQ i barwiono 1% mrówczanem uranylu przez 5 minut.Usuń nadmiar plamy za pomocą chłonnego papieru, a następnie wysusz siatkę na powietrzu.Obrazowanie przeprowadzono na tych siatkach przy użyciu FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN pracującego przy 100 kV.Obrazy zarejestrowano przy powiększeniach x 26 500 i x 43 000 przy użyciu kamery CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Niemcy).Dla każdej próbki (n = 1) rejestrowano 10–15 obrazów.Do analizy obrazu i pomiaru średnic włókien (n = 100, różne włókna) wykorzystano ImageJ (https://imagej.nih.gov/).Pryzmat 9 wykorzystano do wykonania niesparowanych testów t (dwustronnych).Średnie włókienka His-NT2RepCT i NT wynosiły odpowiednio 11,43 (SD 2,035) i 7,67 (SD 1,389) nm.Przedział ufności (95%) wynosi od -4,246 do -3,275.stopnie swobody = 198, p < 0,0001.
80 µl próbek cieczy zawierających 10 µM tioflawiny T (ThT) mierzono w trzech powtórzeniach (n = 3) w warunkach statycznych przy użyciu 96-dołkowych płytek Corning z czarnym dnem i przezroczystym dnem (Corning Glass 3881, USA).Różnice fluorescencji rejestrowano przy użyciu filtra wzbudzenia 440 nm i filtra emisji 480 nm (FLUOStar Galaxy z BMG Labtech, Offenburg, Niemcy).Sygnał ThT nie był ani nasycony, ani wygaszony, ponieważ przeprowadzono eksperymenty z różnymi stężeniami ThT bez zmiany intensywności sygnału.Zarejestrować absorbancję przy 360 nm dla pomiaru zamglenia.Do doświadczeń z zaszczepianiem utworzono żele 100 mg/ml w temperaturze 37°C, ponownie zawieszono i użyto do zaszczepienia w stosunkach molowych 5%, 10% i 20%.Dane analizowano za pomocą Prism 9.
Rozmrozić zapasy His-NT2RepCT i NT >100 mg/ml na lodzie i przesączyć przez filtr 0,22 µm.Stężenia obliczono mierząc absorbancję przy 280 nm przy użyciu Nanodrop.W dołkach 96-dołkowej czarnej niewiążącej płytki (Corning) z przezroczystym dnem próbki rozcieńczono do 20 mg/ml w 20 mM Tris-HCl pH 8 i zmieszano z 5 µM ThT (stężenie końcowe), całkowite stężenie próbki Objętość 50 µl.Próbki obrazowano co 10 minut w temperaturze 37°C na mikroskopie CellObserver (Zeiss) z kanałem światła przechodzącego oraz zestawami filtrów wzbudzenia i emisji FITC do obrazowania ThT.Do obrazowania używany jest obiektyw 20x/0,4.Do analizy obrazu wykorzystano Zen Blue (Zeiss) i ImageJ (https://imagej.nih.gov/).Żele przygotowano także z roztworów NT i His-NT2RepCT w stężeniu 50 mg/ml zawierających 20 mM Tris pH 8 i 5 µM ThT i inkubowano w temperaturze 37°C przez 90 minut.Kawałki żelu przeniesiono do nowej studzienki zawierającej 20 mM Tris, pH 8 i 5 µM ThT w niewiążącej czarnej płytce z przezroczystym dnem o 96 dołkach.Uzyskaj obrazy zielonej fluorescencji i jasnego pola przy powiększeniu 20x/0,4.Do analizy obrazu wykorzystano ImageJ.
Widma NMR w roztworze otrzymano przy 310 K na spektrometrze Bruker Avance Neo o częstotliwości 600 MHz wyposażonym w kriosondę QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Próbki NMR zawierające 10 mg/ml jednorodnego białka znakowanego 13C, 15N, rozpuszczone w 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Do przypisania piku 23 w widmie 2D 15N-HSQC wykorzystano przesunięcia chemiczne NT2RepCT przy pH 6,7.
Widma NMR (MAS) z wirowaniem pod magicznym kątem hydrożeli znakowanych 13C, 15N rejestrowano na spektrometrze Bruker Avance III HD przy 800 MHz wyposażonym w bezelektronową sondę 13C/15N{1H} 3,2 mm.Temperaturę próbki kontrolowano za pomocą strumienia gazu o zmiennej temperaturze wynoszącej 277 K. Dwuwymiarowe widmo dipolowego rezonansu rotacyjnego (DARR)76 i widmo ponownego połączenia częstotliwości radiowej (RFDR)77 uzyskano przy częstotliwościach MAS odpowiednio 12,5 kHz i 20 kHz.Polaryzację krzyżową (CP) od 1H do 13C przeprowadzono przy użyciu liniowej rampy od 60,0 do 48,0 kHz przy 1H, 61,3/71,6 kHz przy 13C (przy 12,5/20 kHz MAS) i czasie kontaktu 0,5–1 ms.Podczas zbierania danych zastosowano oddzielenie Spinal6478 przy 73,5 kHz.Czas akwizycji wynosił 10 milisekund, a opóźnienie cyklu wynosiło 2,5 sekundy.Pojedyncze wiązania Cα/Cβ korelacje obserwowane w widmach RFDR przypisano w oparciu o charakterystyczne przesunięcia chemiczne typu reszt i korelacje z wieloma wiązaniami w widmach DARR.
Do oceny tendencji do trzepotania i energii Rosetty dla NT, NTFlSp i NTMiSp wykorzystano bazę danych Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Baza danych Zipper oblicza Rosetta Energy80, która łączy w sobie kilka funkcji darmowej energii do modelowania i analizowania struktury białek.Poziom energii wynoszący -23 kcal/mol lub niższy wskazuje na wysoką tendencję do fibrylacji.Niższa energia oznacza większą stabilność dwóch nici β w konformacji zamka błyskawicznego.Ponadto algorytm Waltza wykorzystano do przewidywania regionów amyloidogennych w NT, NTFlSp i NTMiSp Nr ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Roztwór białka NT zmieszano z buforem kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES) o pH 5,5 i 6,0 w celu obniżenia pH odpowiednio do pH 6 i 7.Końcowe stężenie białka wynosiło 100 mg/ml.
Pomiary wykonywano na spektrometrze CD J-1500 (JASCO, USA) z użyciem kuwety o pojemności 300 µl i drodze optycznej 0,1 cm.Białka rozcieńczono do 10 µM (n = 1) w 20 mM buforze fosforanowym (pH 8).Aby przeanalizować stabilność białka w obecności soli, białka analizowano w tym samym stężeniu (n = 1) w 20 mM buforze fosforanowym (pH 8) zawierającym odpowiednio 154 mM NaF lub NaCl.Skany temperatury rejestrowano przy 222 nm od 25°C do 95°C z szybkością ogrzewania 1°C/min.Proporcję natywnie sfałdowanych białek obliczono ze wzoru (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Dodatkowo zarejestrowano pięć widm dla każdej próbki od 260 nm do 190 nm w temperaturze 25°C i po ogrzaniu do 95°C.Pięć widm uśredniono, wygładzono i przeliczono na eliptyczność molową.Dane analizowano za pomocą Prism 9.
Intensywność fluorescencji His-NT-GFP (300 mg/ml, 80 µl) mierzono w trzech powtórzeniach (n = 3) w 96-dołkowych płytkach Corning z czarnym przezroczystym dnem (Corning Glass 3881, USA) w warunkach statycznych.Zmierzyć próbki za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek o długości fali wzbudzenia 395 nm i zarejestrować emisję przy 509 nm przed żelowaniem i 2 godziny później w temperaturze 37°C.Dane analizowano za pomocą Prism 9.
Zestaw do oznaczania aktywności fosforylazy nukleozydów purynowych (metoda fluorometryczna, Sigma Aldrich) stosowano zgodnie z instrukcjami producenta.Aby zmierzyć aktywność w żelach i roztworach zawierających His-NT-PNP, zmieszaj 10 ng His-NT-PNP ze 100 mg/ml NT do całkowitej objętości 2 µl, ponieważ żel dał sygnał powyżej zakresu detekcji zestawu.Włączono kontrole dla żeli i roztworów niezawierających His-NT-PNP.Pomiary przeprowadzono dwukrotnie (n = 2).Po zmierzeniu aktywności mieszaninę reakcyjną usunięto i żel sfotografowano, aby upewnić się, że żel pozostał nienaruszony podczas pomiaru.Dane analizowano za pomocą Prism 9.
Więcej informacji na temat projektu badania można znaleźć w streszczeniu badania Nature, do którego link znajduje się w tym artykule.
Ryciny 1 i 2 przedstawiają dane wyjściowe.1c, 2a – c, 3a, b, e – g, 4, 5b, d, f i 6, rysunki uzupełniające.3, rys. uzupełniający.5a, d, rys. uzupełniający.6 i rys. uzupełniający.8. Dane Dane z tego badania znajdują się w bazie danych Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Dane NMR uzyskane w tym badaniu zostały przesłane do repozytorium BMRBig pod wpisem o identyfikatorze bmrbig36.Struktury GFP i PNP zaczerpnięto z PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. i Johansson, J. Przędzenie sztucznego jedwabiu pajęczego.Krajowa Chemia.biologia.11, 309–315 (2015).
Babb, PL i in.Genom Nephila clavipes podkreśla różnorodność genów jedwabiu pajęczego i ich złożoną ekspresję.Geneta Narodowa.49, 895–903 (2017).